miR-145通过mTOR途径调控NSCLC A549细胞生物学特性

李 柱， 吴 烜， 彭小丹， 王树滨

(北京大学深圳医院肿瘤内科，广东省深圳市518000)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最为常见的肺癌种类，虽然其发病率近年来呈现明显改善趋势，但由于缺乏有效的早期鉴别和治疗指标，导致NSCLC患者5年生存率仍较低[1]。因此，积极寻找有效治疗NSCLC的临床靶标具有十分重要的意义。真核生物miRNA属于内源性小非编码RNA，miRNA表达异常在调控细胞增殖、分化、转移、发育、凋亡和侵袭等过程中扮演着十分重要的角色[2]，在癌症发生发展过程中也起到十分重要的作用[3]。近年有研究指出，肝癌、乳腺癌、胃癌、肾癌、喉癌、前列腺癌等多种癌症的发生和发展均与miR-145异常表达关系密切[4]，但miR-145在NSCLC中的作用及机制仍有待研究。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是C羧基端激酶类家族成员，参与细胞DNA修复、端粒长度、周期检查点调整和细胞死亡等多种过程，逐渐成为了近年来临床研究的热点[5-6]。因此，本研究拟分析miR-145调控NSCLC A549细胞生物学特性及对mTOR信号转导通路的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞培养和分组

NSCLC A549细胞购自上海细胞库。miR-145模拟物、阴性模拟物引物均由上海生工生物工程有限公司提供;miR-145抗体、miRNA阴性对照抗体均由Ambion公司提供。A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基培养，5% CO2、37 ℃培养，待细胞长至80%时传代培养或进行干预。细胞生长至对数期时，A549细胞用胰蛋白酶消化，分为miR-145组、对照组、miR-145抗体组和对照抗体组。6孔细胞培养板中每孔接种3.5×105个A549细胞，置于细胞培养箱中培养24 h。除去培养基加入无血清培养基后，用LipofectamineTM2000转染试剂盒进行质粒转染，完成转染后置于细胞培养箱中培养6 h，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基培养细胞。

1.2 qRT-PCR检测miR-145表达

抽提各组细胞总核酸，严格按照反转录试剂盒和qRT-PCR检测试剂盒说明书进行操作，检测细胞中miR-145表达情况。所用引物及试剂盒均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。miR-145上游引物：5′-CGCGCTCGAGCCCAGAGCAATAAGCCACAT-3′，下游引物：5′-GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG TTGAG-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCA CA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3 MTT检测细胞增殖活性

将细胞按照5×103个/孔接种于96孔板中，细胞培养箱中培养48 h后加入20 μL MTT试剂，培养4 h后，采用多功能酶标仪检测光密度(OD490 nm)，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

PBS缓冲液清洗后，调整细胞至1×106个/mL，取100 μL细胞悬液，采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒处理细胞，流式细胞术检测各组细胞凋亡率。细胞处理严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 细胞迁移实验

取细胞接种于6孔板中，37 ℃孵育至板底被铺满，使用100 μL枪头划一条线，保持划痕宽度一致，拍照并做标记，37 ℃孵育24 h。6孔板经PBS清洗后，于显微镜下观察细胞迁移情况，计算迁移至划痕区域中的细胞数量。

1.6 细胞侵袭实验

使用matrigel胶包被Transwell小室后，调整细胞至5×104个/mL，取0.5 mL细胞悬液加入Transwell小室内，培养24 h。取出小室，将上室细胞擦净并用PBS洗涤，预冷甲醇固定下室细胞30 min，结晶紫染色10 min，显微镜下取6个视野计算下室的细胞数。

1.7 Western blotting检测蛋白表达

取各组细胞提取总蛋白，采用BCA定量试剂盒检测蛋白水平。采用SDS-PAGE分离蛋白，将目标蛋白转移至PVDF膜。BSA封闭1 h后，分别使用mTOR、磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR,p-mTOR)、真核细胞翻译起始因子-4E(eukaryotic initiation factor-4E,eIF4E)、磷酸化eIF4E(phosphorylated eIF4E,p-eIF4E)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase,p70S6K)、磷酸化p70S6K(phosphorylated p70S6K,p-p70S6K)、S6核糖体蛋白(ribosomal protein S6,S6)、磷酸化S6(phosphorylated S6,p-S6)、eIF4E结合蛋白1(eIF4E-binding protein，4E-BP)、磷酸化4E-BP(phosphorylated 4E-BP,p-4E-BP)、一抗抗体孵育，4 ℃过夜。TBST洗涤3次后，二抗室温孵育1 h，TBST再次洗涤后，使用增强型化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒检测各组蛋白表达水平。

1.8 统计学方法

2 结 果

2.1 各组miR-145表达水平的比较

对照组和对照抗体组细胞miR-145表达水平差异无显著性(P>0.05)，miR-145组和miR-145抗体组与其比较，细胞miR-145表达水平存在明显差异，其中miR-145组最高，miR-145抗体组最低(P<0.05；图1)。

图1 各组miR-145表达水平的比较。

2.2 各组细胞增殖活性的比较

对照组和对照抗体组细胞增殖活性差异无显著性(P>0.05)，miR-145组和miR-145抗体组与其比较，细胞增殖活性存在明显差异，其中miR-145组最低，miR-145抗体组最高(P<0.05；表1)。

表1 各组细胞增殖活性、凋亡率、迁移活性、侵袭活性的比较(n=5)

2.3 各组细胞凋亡率的比较

对照组和对照抗体组细胞凋亡水平差异无显著性(P>0.05)，miR-145组和miR-145抗体组与其比较，细胞凋亡水平存在明显差异，其中miR-145组最高，miR-145抗体组最低(P<0.05；表1和图2)。

图2 各组细胞凋亡率的比较(流式细胞术)

2.4 各组细胞迁移活性的比较

对照组和对照抗体组细胞迁移活性差异无显著性(P>0.05)，miR-145组和miR-145抗体组与其比较，细胞迁移活性存在明显差异，其中miR-145组最低，miR-145抗体组最高(P<0.05；表1和图3)。

图3 各组细胞迁移结果的比较

2.5 各组细胞侵袭活性的比较

对照组和对照抗体组细胞侵袭差异无显著性(P>0.05)，miR-145组和miR-145抗体组与其比较，细胞侵袭存在明显差异，其中miR-145组最低，miR-145抗体组最高(P<0.05；表1和图4)。

图4 各组细胞侵袭活性的比较(结晶紫染色，200×)

2.6 各组细胞mTOR信号通路蛋白表达的比较

对照组和对照抗体组细胞p-mTOR/mTOR、p-eIF4E/eIF4E、p-p70S6K/p70S6K、p-S6/S6、p-4E-BP/4E-BP表达水平差异无显著性(P>0.05)，miR-145组和miR-145抗体组与其比较，细胞p-mTOR/mTOR、p-eIF4E/eIF4E、p-p70S6K/p70S6K、p-S6/S6、p-4E-BP/4E-BP表达水平存在明显差异，其中miR-145组各指标表达水平最低，miR-145抗体组最高(P<0.05；图5)。

图5 Western blotting检测各组细胞mTOR信号通路蛋白的表达

3 讨 论

miRNA是人体内重要的生物活性分子，可靶向mRNA的3′-UTR区，起到抑制mRNA翻译或降解mRNA的作用，可有效调节细胞凋亡、增殖、转移。有报道指出，miRNA的表达异常在肿瘤发生的各阶段均可检测到，并扮演一定的癌基因和抑癌基因的作用[7]。有学者指出，肝外胆管癌中miR-143处于低表达状态，miR-143表达水平升高可显著抑制胆管癌细胞增殖，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡[8]。胆管癌细胞中miR-26a表达上调可促进肿瘤细胞大量增殖[9]。miRNA具有十分重要的生物学功能，但其作用机制仍需要进一步研究和分析。miR-145在基因组中位于5号染色体，常被认为属于抑癌基因。有研究指出，miR-145可作用于信号转导和转录激活因子1、人表皮生长因子受体2、表皮生长因子受体等基因，对细胞多种生物学行为进行调控[10]。此外，miR-145在胃癌、前列腺癌、宫颈癌等肿瘤组织中均处于低表达状态，miR-145表达增加会抑制肿瘤扩散，具有一定的抑制肿瘤作用[11]。本研究选择miR-145，分析其在肺癌细胞A549中的生物学特征及其作用机制。

本研究结果显示，A549细胞高表达miR-145后，细胞增殖活性、迁移能力及侵袭能力均显著降低，细胞凋亡率显著升高，说明miR-145表达增加后可显著降低A549细胞的增殖活性、迁移能力及侵袭能力，并有效升高细胞凋亡率。

mTOR是调控和联系细胞代谢上下游的关键分子，可通过脂肪合成、蛋白翻译等系统抑制细胞自噬，发挥生物学活性。有研究指出，非磷酸化4E-BP1结合在eIF4E上可有效抑制其生物学活性，而mTOR可调控蛋白翻译促进S6K1和4E-BP1磷酸化，当4E-BP1磷酸化后，会与eIF4E解离，使eIF4E招募翻译起始因子复合体[12]。当mTOR促进S6K1磷酸化后，会促进其底物翻译，此外S6K1可增强RnAPI转录活性，诱导核糖体生物合成，mTOR可通过SREBP1间接上调脂肪酸合成酶表达水平和活性，调控脂肪酸代谢进程，因而在肿瘤的发生和发展过程中mTOR信号通路扮演着十分重要角色[13]。本研究进一步分析miR-145潜在的作用机制发现，miR-145高表达会显著抑制mTOR、eIF4E、p70S6K、S6、4E-BP蛋白磷酸化。本研究结果提示，miR-145通过mTOR信号通路实现对A549细胞的生物学调控。

综上所述，miR-145可通过mTOR途径调控NSCLC A549细胞生物学特性，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖活性、迁移能力及侵袭能力。但本研究并未就miR-145的基因作用网络进行深入探讨，有待后续研究分析。