重症流行性出血热患者PBMC 中Fas/FasL 表达及免疫机制研究*

李珊

（福建省南平市第一医院重症医学科 南平 353000）

流行性出血热（Epidemic Hemorrhagic Fever,EHF）又称肾综合征出血热，具有一定的地域性，山区多见。南平市地处闽北山区，各类啮齿类动物比较多见，是汉坦病毒携带的宿主[1]。每年我市EHF 发病率比较高，汉坦病毒由于具有泛嗜性的特点，对各脏器均有致病力，所以容易导致多脏器功能障碍，如不及时辨别，极易进展为重症病例[2]。况且本病临床表现并不特异，容易误诊，往往错过最佳治疗时机[3]。免疫损伤机制是EHF 发病的重要机制之一，Fas/FasL 是介导各类细胞凋亡的重要途径，但关于Fas 和FasL 在重症EHF 患者不同阶段外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC）中表达情况的研究尚较少见[4]。本研究探讨Fas/FasL在汉坦病毒感染后机体中的表达情况及其免疫反应机制。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年4月至2021年4月在我院重症监护室住院治疗的50例重症EHF 患者为研究对象。其中男 29例，女 21例；年龄 23～76 岁。研究对象严格根据病情分期进行分组，分为以下5组：发热期组（Ⅰ期组）、低血压休克期组（Ⅱ期组）、少尿期组（Ⅲ期组）、多尿期组（Ⅳ期组）和恢复期组（Ⅴ期组）。纳入标准：符合1986年全国流行性出血热会议制定的诊断标准，EHF 抗体IgM 阳性，具有典型的5 期经过，同时排除其他重症疾病[5]。患者及其家属对研究内容知情并签署知情同意书。本研究获得医院医学伦理委员会批准（编号：2017NO.03）。

1.2 设备和试剂 高糖DMEM 培养液（Gibco 公司，美国）；GIS 凝胶成像分析系统（瓦兰科技有限公司，上海）；高速冷速离心机（昊诺斯科技有限公司，北京）；二氧化碳培养箱（沃信仪器有限公司，无锡）；人Fas 单克隆抗体、兔抗人FasL 单克隆抗体（谱析生科有限公司，上海）；PBMC 分离液（益普生物科技有限公司，武汉）；人肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的ELISA 试剂盒（心语生科有限公司，上海）。

1.3 PBMC 分离采集 分别抽取患者5 期的静脉血8 ml（肝素抗凝），加入PBS 稀释2 倍，混匀，将PBMC 分离液加入标本中，吸出单核细胞层，再用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，离心5 min，弃上清液，制成细胞悬液，采用高糖DMEM 培养液培养。

1.4 双重吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）染色测PBMC凋亡 将PBMC 进行培养，根据不同培养时间（1 h、6 h、12 h 及24 h）观察凋亡情况，然后给予AO/EB染色，按操作步骤进行固定、染色，最后使用荧光显微镜观察。根据不同AO/EB 染色的颜色区别正常细胞、早期和晚期凋亡细胞。计算公式如下：PBMC 凋亡率＝（凋亡早期细胞+ 凋亡晚期细胞）/ 细胞总数×100%。

1.5 Western Blot 检测Fas 和FasL 蛋白表达 使用分离液得到PBMC，配成细胞悬液，高糖DMEM 培养液培养24 h，培养后加入胰酶吹打消化，离心（1 000 r/min，10 min）获得 PBMC 细胞，加入裂解缓冲液，离心（1 200 r/min，15 min）获得蛋白，同时检测所得蛋白的浓度。根据Western Blot 操作步骤：取样、凝胶电泳分离、湿法转膜、移至PVDF 膜上、封闭2 h、洗膜，然后加 Fas、FasL 和 GAPDH 一抗孵育（4℃过夜），TBST 洗 30 min，重复 3 次，加入二抗（辣根过氧化物酶标记）孵育2 h；最后曝光、显影、定影；Bandscan 5.0 图像分析出血热患者各期蛋白的分子量，以Fas、FasL 与GAPDH 蛋白灰度值比值做结果。

1.6 RT-PCR 法检测 Fas 和 FasL mRNA 表达 每组取 100 μl 的 PBMC 细胞悬液，加入 Trizol 裂解液（200 μl），提取总 RNA，使用分光光度计检测 RNA浓度，按PCR 试剂盒步骤逆转录cDNA，将Fas 和FasL mRNA 的PCR 扩增产物进行电泳，最后用凝胶成像系统分析条带。Genbank 库查询目标基因序列。见表1。

表1 Fas、FasL 和 β-actin 引物序列

1.7 ELISA 法检测人 TNF-α 和 IL-6 水平 严格依据TNF-α 和IL-6 的酶联试剂盒说明书操作。

1.8 观察指标 比较各组PBMC 细胞凋亡率，外周血中 TNF-α、IL-6 水平，Fas、FasL 基因和蛋白表达水平。

1.9 统计学方法 采用SPSS24.0 软件进行统计。各组计量资料符合正态分布以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用t检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重症EHF 患者5 期PBMC 凋亡率 不同时间点Ⅰ期组、Ⅱ期组和Ⅲ期组PBMC 细胞凋亡率与Ⅳ期组、Ⅴ期组比较升高，尤其Ⅰ期组PBMC 凋亡率最高，各时间点组间比较有差异（1 h：F=29.12，P＜0.001；6 h：F=27.54，P＜0.001；12 h：F=25.23，P=0.003，24 h：F=18.17，P=0.005）。Ⅳ期组和Ⅴ期组比较提示两组间的PBMC 凋亡率无显著性差异（P＞0.05）。见表2。

表2 重症 EHF 患者 5 期 PBMC 凋亡率（%，）

表2 重症 EHF 患者 5 期 PBMC 凋亡率（%，）

分组 n 1 h 6 h 12 h 24 hⅠ期组Ⅱ期组Ⅲ期组Ⅳ期组Ⅴ期组50 50 50 50 50 28.34±6.76 19.46±4.88 10.54±2.87 4.28±1.12 3.75±0.87 24.25±6.13 17.57±3.93 8.69±2.74 4.03±1.31 3.43±0.61 19.46±4.68 16.11±3.58 6.83±1.39 3.68±0.87 3.23±0.59 15.36±3.18 12.35±3.16 4.81±1.32 3.54±0.68 2.92±0.51

2.2 重症 EHF 患者 5 期 PBMC 中 Fas 和 FasL 蛋白表达 重症EHF 患者前3 期组Fas 和FasL 蛋白表达水平与Ⅳ期组、Ⅴ期组比较明显升高，组间差异均有 统 计 学 意 义 （Fas：F=36.43，P＜0.001；FasL：F=33.65，P＜0.001）；Ⅳ期组和Ⅴ期组的 Fas 和 FasL 蛋白表达均无显著性差异（P＞0.05）。见图1、表3。

图1 重症EHF 患者PBMC 中Fas 和FasL 蛋白表达

表3 5 期重症 EHF 患者的 Fas 和 FasL 蛋白表达情况（ng/ml，）

表3 5 期重症 EHF 患者的 Fas 和 FasL 蛋白表达情况（ng/ml，）

分组 n Fas FasLⅠ期组Ⅱ期组Ⅲ期组Ⅳ期组Ⅴ期组50 50 50 50 50 1.23±0.36 0.77±0.18 0.41±0.11 0.26±0.08 0.14±0.05 1.19±0.32 0.81±0.21 0.52±0.13 0.31±0.09 0.19±0.07

2.3 重症 EHF 患者 5 期 PBMC 中 Fas 和 FasL mRNA 表达 RT-PCR 结果显示 Fas 和 FasL mRNA在Ⅰ期组、Ⅱ期组、Ⅲ期组中均呈高表达，而Ⅳ期组和Ⅴ期组中表达量比较低，组间比较具有统计学差异（Fas：F=15.89，P=0.007；FasL：F=14.54，P=0.011）；Ⅳ期组和Ⅴ期组的Fas 和FasL mRNA 表达均无统计学差异（P＞0.05）。见表4。

表4 5 期重症 EHF 患者的 Fas 和 FasLmRNA 表达情况（ng/ml，）

分组 n Fas FasLⅠ期组Ⅱ期组Ⅲ期组Ⅳ期组Ⅴ期组50 50 50 50 50 9.32±2.34 7.63±1.56 5.24±1.24 2.38±0.39 1.84±0.25 11.67±3.38 9.79±2.53 6.32±1.89 2.67±0.44 1.99±0.41

2.4 重症 EHF 患者 5 期 PBMC 中 TNF-α 和 IL-6表达 前3 期组TNF-α 和IL-6 表达水平与Ⅴ期组比较明显升高，尤其是Ⅰ期组致炎因子水平最高，Ⅳ期组表达量水平相对较低，组间差异有统计学意义（TNF-α：F=42.35，P＜0.001；IL-6：F=31.27，P＜0.001）。见表5。

表5 重症 EHF 患者 PBMC 中 TNF-α 和 IL-6 表达（μmol/L，）

分组 n TNF-α IL-6Ⅰ期组Ⅱ期组Ⅲ期组Ⅳ期组Ⅴ期组50 50 50 50 50 115.32±21.34 101.63±18.56 93.24±16.74 65.38±14.26 34.64±7.47 123.45±5.67 97.45±24.21 89.45±16.79 67.32±13.47 23.34±4.98

3 讨论

南平地区处于山区，EHF 实质上是一种地域性疾病，十个县市患者临床特点无明显差异，病毒基本来源同一种属，病毒致病力相似[6]。大多数重症患者具有典型5 期表现，部分患者可出现多期重叠表现，主要的表现是发热、充血、出血、肾功能异常、低血压，甚至少尿、无尿、休克等[7～8]。汉坦病毒是一种有包膜的负链RNA 病毒（包括L、M 和S 3个基因组），属布尼亚病毒科，可以编码核蛋白、G 糖蛋白、L聚合酶蛋白[9～10]。已经证实病毒的直接致病是主要发病机制，肾脏是主要靶器官，在早期阶段即会出现原发性损伤，但对免疫损伤机制仍有待探索。

本研究发现重症EHF 患者各期外周血PBMC的Fas 表达升高，尤其是前期阶段，与恢复期的患者比较具有显著性，发热期患者Fas 表达明显最强，随着病程的推移，表达也逐渐下降，重症EHF 患者各期之间存在差异。重症EHF 患者外周血PBMC 中FasL 的表达在发热期、低血压休克期、少尿期也明显增强，而在多尿期、恢复期患者表达相对较低。有研究表明，FasL 在T 淋巴细胞表达量明显[11]，FasL可以与Fas 进行结合，相互结合后机体对Fas+靶细胞发挥细胞毒的生物活性，从而反馈性引起免疫细胞凋亡。

重症EHF 患者病程早期PBMC 凋亡率最高，而且血涂片中会发现大量异型淋巴细胞，实质上也是一种免疫活化的淋巴细胞，在细胞免疫中起着重要的作用，参与机体的免疫损伤[12～13]。我们亦发现早期外周血PBMC 中Fas 和FasL 的表达均明显增强，与汉坦病毒全身血症的级联爆发时间相吻合，随着病程进展，在疾病的多尿期和恢复期，两者PBMC细胞凋亡率无显著性差异（P＞0.05）。重症EHF 患者不同时期的TNF-α 和IL-6 表达水平也有所不同，均较恢复期的患者炎症水平高，尤其是发热期的患者炎症指标升高最明显，也提示我们要遵循早诊断、早治疗的原则，早期控制本病对防止重症化是非常关键的[14～15]。

综上所述，Fas、FasL 浓度高低与机体损害的程度有关，该途径可能介导重症EHF 患者5 期发展的致病过程，对外周血单个核细胞具有免疫调控作用；如果能有效抑制Fas/FasL 途径，可以减轻免疫损伤，对改善病毒血症反应具有一定的临床价值。