海藻酸钠肠溶包被氧化锌微球的制备

曹清贻，李宝霞，肖美添，陈嘉伟

（华侨大学化工学院化学工程与制药工程专业，福建 厦门 361021）

锌是动物必需的微量元素之一，参与300多种酶的合成，与动物肠道发育和免疫功能密切相关。目前的研究认为氧化锌是锌可以抵抗肠道疾病的唯一无机形式[1]。许多研究和实践经验表明，在断奶仔猪日粮中添加一定剂量的氧化锌可以降低腹泻的发生率，提高仔猪的生长性能[2-3]。但仔猪日粮中的氧化锌很容易被胃里的酸性胃液分解，大部分氧化锌转化为Zn2+，随粪便排到环境中，只有10%～25%的氧化锌能到达肠道，被仔猪吸收[4]。所以仔猪日粮中必须添加高剂量的氧化锌（质量分数2～3 g/kg）才能有效抑制仔猪腹泻[2-3]。锌在土壤中的过量积累会导致土壤质量恶化，对植物产生毒性，并可能危害动物和人类健康[5-7]。根据农业部的《饲料添加剂安全使用规范》（农业部公告第2625号），仔猪断奶后前2周允许添加的氧化锌的质量分数最高不超过1.6 g/kg，相比2009年颁布的添加标准质量分数2.25 g/kg显著降低[8]。因此，研制符合规范要求的氧化锌添加剂迫在眉睫。

对氧化锌进行包被处理，包衣层能够保护氧化锌不被胃液降解，而在肠道释放并被仔猪吸收，可以有效提高氧化锌的利用率，显著降低饲料中氧化锌的添加量[9-12]。

海藻酸钠（SA）是褐藻中发现的一种天然无毒多糖[13]。它具有成本低、生物相容性好和可降解等优点，已广泛应用于药物载体，它具有pH 敏感性，在高pH时易溶解[14-45]。壳聚糖（CTS）是一种广泛应用于胃肠道给药载体的生物聚合物[16]。它具有良好的生物相容性和生物降解性，且易于改性，常用于输送药物和生物活性化合物[15]。SA 与CTS可在温和条件下瞬间胶凝，形成聚合膜胶囊[17]；还可与2 价阳离子如Ca2+、Ba2+等（除Mg2+）交联反应形成“蛋格”结构而瞬时凝胶化，从而形成凝胶微球[18]。SA属于肠溶性囊材，所以CTS-SA微胶囊具有一定的耐酸性和肠溶性[23]。SA 微球已广泛应用于生物技术和制药工业[13]。

徐文俊的实验结果表明，CTS-SA微囊能够显著降低微囊在胃液中的释放度，在模拟胃液中处理2 h，微囊的释放率不超过22%，而在模拟肠液中，4 h后微囊的累计释放率达到87%，6 h后可完全释放[19]。还有许多实验证明，CTS-SA 包被微球可以减少药物在模拟胃液中的释放，但可以加速药物在模拟肠液中的释放[20-22]。

本研究采用SA、CTS、氯化钙作为包被材料制取肠溶包被氧化锌微球，以期获得以SA和CTS作为载体制取包被氧化锌的优化配方及工艺条件，为降低仔猪饲料中氧化锌添加量提供有效方法和替代产品。CTS-SA包被氧化锌肠溶微球

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

氧化锌，无水氯化钙，CTS，乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA），磷酸二氢钾，氢氧化纳，分析纯；SA，化学纯。

电子天平，HZK-FA210S；pH 计，ST2100；集热式恒温加热磁力搅拌器，DF-101S；智能崩解仪，ZB-1E。

1.2 微球制备方法

采用锐孔凝固浴法制备CTS-SA包被氧化锌肠溶微球[23]。将SA（1～5 g）融入100 g 热水中，用集热式恒温加热磁力搅拌器搅拌15 min，使SA 完全溶解。将氧化锌（10～30 g）加入到已溶解的SA 溶液中，恒温均匀搅拌15 min，然后用注射器将混合物滴入到氯化钙溶液（质量分数1%～5%）中，使其搅拌交联2 h后固化，再进行抽滤之后分离微球。之后将微球转移到CTS 溶液（质量分数0%～0.5%）中，继续搅拌交联2 h后抽滤，分离微球并用蒸馏水洗涤，干燥至恒量，得到包被微球。

实验过程中以SA、氯化钙、CTS 的质量分数分别为3%、3%、0.25%，氧化锌投加质量分数20%作为基本的实验条件，改变单一条件制备一系列微球。

1.3 氧化锌含量分析

采用GB/T4372.1－2014 中的Na2EDTA 滴定法来测定微球中氧化锌含量[24]。

1.4 微球的体外释放

氧化锌的体外释放参照《中国药典（2010版）》附录XD释放度测定法中肠溶制剂项下方法一的要求，对微球进行体外释放研究[25]。将1 g 微球放入模拟胃液中，溶出介质温度定在(37±0.5)℃，每隔一定的时间取样5 mL，用微孔滤膜过滤，并补入等量模拟胃液原液。2 h 后将上述微球放入模拟肠液中，每隔一定的时间取样3 mL，用微孔滤膜过滤，并补入等量模拟肠液，继续运转2 h。

模拟胃液。在清水中，滴加盐酸，至溶液pH为1.5，得到溶液500 mL。

模拟肠液。称量6.8 g KH2PO4于500 mL 的清水中，用NaOH溶液将溶液调成pH为6.8。

1.5 微球的质量评价

采用光学显微镜对微球形态的观察。

测定粒径大小采用显微计数法，在光学显微镜下，随机测定3个微球的大小，得到微球的平均粒径。

根据《药典》附录中“微囊、微球与脂质体制剂指导原则”部分关于2个概念的定义可知[24]：

包封率=系统中包封的药物质量/系统中包封与未包封的总质量；

载药量=微球中所含药物质量/微球的总质量；

收率=微球的总质量/总投加质量。

2 结果与讨论

2.1 SA含量的影响

固定氯化钙、CTS 的质量分数分别为3%、0.25%，氧化锌投加质量分数为20%，制备SA 的质量分数分别为1%、3%、5%的微球。所得微球形貌见图1。

图1 SA含量对微球形貌的影响Fig1Effectof SAconcentrations onmorphologyof microspheres

由图1可知，当SA的质量分数为1%时，微球成椭圆状，可能是因为低含量的SA 的黏度比较小，而导致微球的变形。而当SA 的质量分数为5%时，微球不成球状接近水滴状，可能是SA含量过高时其黏度比较大，物料乳化不均匀。所以不再进行SA 的质量分数为5%时的其它因素（载药量、包封率、体外释放量等）的实验。

SA 含量对微球的体外释放程度的影响如图2所示。

图2 SA含量对微球的体外释放程度的影响Fig 2 Effect of SA content on in vitro release of microspheres

微球在模拟胃液中2 h 内不崩解。由图2 可知，在进入模拟肠液2 min内就开始溶解。当微球中SA 的质量分数为1%时，微球溶解率增加缓慢，50 min后趋于平衡，微球溶解完毕，总体溶解率很低；当微球中SA 的质量分数为3%时，微球溶解率在20～30 min 时增加迅速，50 min 趋于平衡，微球完全溶解完毕。因此SA 的质量分数为3%时的微球在模拟肠液中的释放度较好。

SA含量对微球的特性的影响见表1。

表1 SA含量对微球的特性的影响Tab 1 Effect of SA content on properties of microspheres

由表1 可知，当SA 的质量分数从1%增至5%时，微球的粒径分布逐步变宽。，SA的质量分数为1%、3%时，SA 微球在模拟胃液中均不溶。SA 的含量对微球在肠液中完全释放的时间几乎没有影响。所以当SA 的质量分数在3%左右时制得的微球较为理想。

2.2 氯化钙含量的影响

固定SA、CTS 的质量分数分别为3%、0.25%，氧化锌投加质量分数为20%，制备氯化钙质量分数分别为1%、3%和5%的微球。氯化钙含量对微球的体外释放程度的影响见图3。

微球在模拟胃液中2 h内不崩解。由图3可知，进入模拟肠液2 min 内就开始溶解，且在20～30 min直接溶解率增速最大。当氯化钙的质量分数为1%时，微球溶解率在40 min 之后趋于平衡，50 min后微球溶解完毕，在40 min 之后曲线下滑的原因可能是随着时间的延长氧化锌逐渐沉淀从而导致溶液含量降低；当氯化钙的质量分数为3%或5%时，微球溶解率均在40 min后趋于平衡，且微球分别在60 min 和70 min 后完全溶解完毕。因此氯化钙的质量分数为3%时的微球在模拟肠液中的完全释放释放时间较5%的短，且两者载药量相差不大。

图3 氯化钙含量对微球体外释放的影响Fig 3 Effect of CaCl2 concentrations on in vitro release of microspheres

氯化钙含量对微球的特性的影响见表2。

表2 氯化钙含量对微球的特性的影响Tab 2 Effect of CaCl2 content on properties of microspheres

由表2 可知，当氯化钙的质量分数从1%增至3%时，微球包封率明显增加，这可能是氯化钙的含量适当的上升对交联反应的发生有正向作用；但随着氯化钙含量的持续上升，包封率没有明显增加。氯化钙的质量分数分别为1%、3%、5%时，微球在模拟胃液中均不溶。氯化钙含量对微球在模拟肠液中的释放时间影响不大，但当氯化钙含量相对较高时，其对微球性质有一定影响，所以之后的实验可以选择氯化钙的质量分数为3.5%、4%和4.5%做进一步考察。

2.3 CTS含量的影响

固定SA、氯化钙的质量分数均为3%，氧化锌投加质量分数为20%，制备CTS 质量分数分别为0%、0.25%和0.5%的微球。CTS 含量对微球的体外释放程度的影响见图4。

图4 CTS含量对微球的体外释放程度的影响Fig 4 Effect of CTS content on in vitro release of microspheres

微球在模拟胃液中2 h内不崩解。由图4可知，进入模拟肠液2 min 内就开始溶解，在20～30 min之间溶解率增速最快。当CTS 的质量分数为0 时，微球溶解率在40 min 之后趋于平衡，溶解完毕。在50 min 之后曲线下滑的原因可能是随着时间的延长，氧化锌逐渐沉淀从而导致溶液中含量降低，且氧化锌释放量较低，包封率较低；当CTS的质量分数为0.25%时，微球溶解率在60 min后趋于平衡，微球溶解完毕；当CTS 的质量分数为0.5%时，微溶解率在80 min 后趋于平衡，溶解完毕。因此CTS的质量分数为0.25%时的微球在模拟肠液中的释放量较好。

CTS含量对微球特性的影响见表3。

表3 CTS含量对微球的特性的影响Tab 3 Effect of CTS content on properties of microspheres

由表3可知，若原料配方含CTS，则微球的包封率明显高于不含CTS 的。当微球的CTS 的质量分数从0.25%升至0.5%时，包封率下降，这可能是CTS含量过高，导致CTS与SA发生聚集，因此包封率下降。CTS的质量分数分别为0、0.25%、0.5%时，微球在模拟胃液中均不溶。随着CTS含量的增加，微球在模拟肠液中完全释放所需要的时间明显增加。因此，当CTS的质量分数在0.25%左右时，可以制得比较理想的微球。之后做进一步考察实验时可以选择CTS的质量分数为0.2%和0.3%。

2.4 氧化锌投加量的影响

固定SA、氯化钙、CTS 的质量分数分别为3%、3%、0.25%。氧化锌投加质量分数分别为10%、20%和30%微球。氧化锌投加量对微球的体外释放程度的影响如图5所示。

图5 氧化锌含量对微球的体外释放的影响Fig 5 Effect of ZnO content on in vitro release of microspheres

微球在模拟胃液中2 h 内不崩解。由图5 可知，进入模拟肠液2 min 内开始溶解，溶解率在20～30 min之间增加迅速。当氧化锌投加质量分数10%时，微球在60 min之后溶解完毕，在60 min之后曲线略有下滑的原因可能是随着时间的延长，氧化锌逐渐沉淀从而导致溶液中含量降低；当投加质量分数为20%时，微球溶解率在30～60 min仍然继续增加，60min 后趋于平衡，微球溶解完毕；当投加质量分数为30%时，微球溶解率在30 min 之后增加缓慢，70 min 后趋于平衡，溶解完毕。因此，氧化锌投加质量分数为10%时的微球在模拟肠液中的释放量最好。

氧化锌投加量对微球特性的影响见表4。

由表4可知，随着氧化锌投加量的上升，微球粒径显著增大，包封率下降，在模拟肠液中完全释放的时间变长。由实验可知，氧化锌投加质量分数分别为10%、20%、30%时，在模拟胃液中均不溶。之后的实验可以选择选择氧化锌投加质量分数分别为15%和25%做进一步考察。

3 结 论

以氧化锌为主要药物，SA 为载药载体，制备SA 肠溶包被氧化锌微球。通过单因素考察得到的优化配方为：SA、氯化钙、CTS 的质量分数分别为3%、3%、0.25%，氧化锌投加质量分数为10%。在些条件下所制得的微球微球形态圆整、粒径分布均匀、包封率相对较高，且体外释放溶出的实验证明微球在模拟胃酸中释放量小于5%，可以有效避免氧化锌在模拟胃液中被分解；在pH 为6.8 的模拟肠液中，所制得微球在0.5 h 内的释药量大于80%，能达到药物的快速释放与产生作用的目的。