薯蓣皂苷通过p38MAPK/NF-κB通路对支气管哮喘幼鼠气道炎症及气道重塑的作用机制研究

齐莎莎 张国伟 张旭亚 付晓梅

支气管哮喘(bronchial asthma，BA)是常见的慢性呼吸道疾病，常发于3岁以下儿童，临床表现为反复性气促、咳嗽、喘息等[1]。流行病资料调查显示[2]，BA发病率逐年上升，全球确诊人数超过2亿人。目前临床治疗BA通常采用激素吸入疗法，可有效减轻炎症反应，短期内改善气喘症状，但对于重症及激素抵抗型患儿疗效并不理想，且可引发失声、骨质疏松、霉菌性咽炎等不良反应[3]。因此，探索高效、安全的BA治疗药物，对于减少其发作、减轻发作程度、改善患儿生存质量意义重大。薯蓣皂苷(diosgenin，Dio)提取自中药穿龙薯蓣，具有增强性功能、降血脂、抗炎、抗肿瘤等药理作用[4]。有研究表明[5]，Dio可抑制肺组织病理变化及炎性细胞浸润，从而减轻急性肺损伤。但目前关于其用于BA治疗的报道尚少，且缺乏对应的机制研究。本研究通过建立BA幼鼠模型，研究Dio对其治疗作用，并探讨相关机制。

资料与方法

一、实验动物

无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)级雄性BALB/c幼鼠40只，7日龄，体质量(5.45±0.35)g，购自上海灵畅生物科技有限公司，生产许可SCXK(沪)2018-0003。

二、药物、主要试剂、仪器

Dio(纯度>98%，上海一研生物科技有限公司)，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)/核转录因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)信号通路激活剂anisomycin(上海源叶生物科技有限公司)，白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒(上海联硕生物科技有限公司)，兔抗幼鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB、p-NF-κB、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、p-ERK1/2蛋白一抗(美国R&D公司)。

流量型整体体积描记箱、整体体积描记系统(美国Buxco公司)，DP12光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社)，iMark酶标仪(美国Bio-Rad公司)，DYCZ-40B电泳仪、WD-9413一体式凝胶成像系统(北京六一生物科技有限公司)。

三、建立BA幼鼠模型[6]

取全部BALB/c幼鼠，随机选择10只设为Control组，其余30只幼鼠建立BA模型，腹腔注射致敏剂(卵清蛋白20 μg与氢氧化铝2 mg混合溶液)0.1 mL，致敏14天后同剂量注射二次致敏，第24天雾化吸入卵清蛋白生理盐水溶液8 mL，每天1次，持续3天。建模完成后观察幼鼠出现呼吸急促、频繁喷嚏、异常躁动等现象，表示建模成功。成功30只，随机分为BA组、Dio组、Dio联合anisomycin组，各10只。

四、干预方式

Dio组灌胃Dio生理盐水溶液1 mL(含药量80 mg/kg)，Dio联合anisomycin灌胃Dio生理盐水溶液1 mL(含药量80 mg/kg)后腹腔注射Anisomycin 2 mg/kg，Control组、BA组灌胃、腹腔注射等体积生理盐水。每天1次，持续2周。

五、检测肺功能指标

末次干预后4 h切开幼鼠颈部，找出其第3与第4气管，行倒T型气管插管于气管环中并勒紧插管，连接呼吸机放置于体描箱内，采用AniRes 2005软件监测并记录幼鼠肺容积(lung volume，LV)及每分钟静息通气量(resting ventilation per minute,VE)。

六、检测肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)炎症因子IL-1β、TNF-α水平

幼鼠肺功能指标检测后，腹腔注射戊巴比妥钠深度麻醉，脱颈处死，迅速摘取左右两肺，右肺分成两份，一份用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋并切片后用于HE染色，一份投入液氮中用于蛋白检测；左肺用生理盐水0.3 mL灌洗5次，回收BALF，4℃离心取其上清。采用ELISA法检测BALF中IL-1β、TNF-α含量，按照试剂盒说明书要求设计实验步骤，酶标仪测定波长570 nm位置吸光度值，画出标准曲线计算IL-1β、TNF-α水平。

七、HE染色测量气道重塑指标、观察肺组织病理变化

取肺组织切片，常规脱蜡，无水酒精冲洗后自来水冲洗20 s，加入苏木精液染色，自来水冲洗，盐酸酒精分化，自来水冲洗后促蓝液反蓝，伊红液染色2 min，梯度酒精脱水、透明、晾干，封片剂封片，每张切片随机选取5个不相邻视野，拍照测量膜性细支气管(直径750～1100 μm，长径/短径≥0.7 μm)管壁外径、面积、厚度及气管总面积，计算MT%、MA%。MT%=管壁厚度/外径，MA%=管壁面积/气管总面积；光学显微镜下观察肺组织病理变化。

八、Western blot法检测肺组织p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达

取液氮保存的肺组织研磨器研磨，加入PBS洗涤匀浆后，注入离心管，RIPA裂解液裂解，冰上8 000 r/min离心20 min(离心半径10 cm)，经BCA试剂盒定量蛋白。取50 μg样品按比例与上样缓冲液混合，金属浴加热5 min，离心取其上清，电压80 V行上样电泳分离后，改电压110 V湿转PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗膜，加入兔抗幼鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2一抗(1：500)，4 ℃孵育2 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗(1:2 000)，常温孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL发光液显色，暗室曝光，经一体式凝胶成像系统扫描拍照，分析灰度值，以目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值表示蛋白相对表达量。计算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2。

九、统计学处理

结 果

一、肺功能

与Control组比较，BA组LV、VE减少(P<0.05)；与BA组比较，Dio组LV、VE增加(P<0.05)；与Dio组比较，Dio联合anisomycin组LV、VE减少(P<0.05)(见表1)。

表1 各组幼鼠肺功能指标比较

二、BALF中炎症因子水平

与Control组比较，BA组IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)；与BA组比较，Dio组IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)；与Dio组比较，Dio联合anisomycin组IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)(见表2)。

表2 各组幼鼠BALF中炎症因子水平比较

三、气道重塑指标

与Control组比较，BA组MT%、MA%升高(P<0.05)；与BA组比较，Dio组MT%、MA%降低(P<0.05)；与Dio组比较，Dio联合anisomycin组MT%、MA%升高(P<0.05)(见表3)。

表3 各组幼鼠气道重塑指标比较

四、HE染色观察肺病理学改变

Control组肺组织及肺泡腔均具有清晰、完整的结构，肺泡壁未观察到渗出、增宽，肺泡间隔、支气管管腔中无炎性细胞浸润、水肿、分泌物渗出；BA组肺泡壁厚度不一，血管壁厚度增加，肺部血管周围存在大量炎性细胞浸润，肺泡上皮细胞及肺间质细胞增生，肺泡数量明显减少；Dio组、Dio联合anisomycin组干预后肺部炎性细胞浸润减弱，病理症状有所缓解，Dio组改善效果较Dio联合anisomycin组明显(见图1)。

图1 HE染色观察各组非组织病理变化(×400，标尺25 μm)

五、肺组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2比较

与Control组比较，BA组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2升高(P<0.05)；与BA组比较，Dio组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2降低(P<0.05)；与Dio组比较，Dio联合anisomycin组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2升高(P<0.05)(见表4，图2)。

表4 各组幼鼠肺组织p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达

图2 Western blot法检测肺组织p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达

讨 论

BA是多种细胞和炎症介质参与的变态反应性气道炎症疾病，鼻炎、反复性呼吸道感染、居住环境过敏原及湿疹是其主要危险因素[7-8]。BA发病机制复杂，目前认为与黏液高分泌、慢性气道炎症、气道高反应性、气道重塑、遗传及免疫反应等有关[9]。中医认为哮喘属于“哮病”范畴，病机主要为肺脾亏虚、宿痰堆积，即肺脾不固，外邪侵入客居于肺，阻塞气机而肺气郁滞，以致痰浊内蕴而发哮喘，故治疗应以益肺、固本、祛痰为主[10]。

气道炎症反应是引发BA的基础，其表现为Th2细胞释放IL-1β、IL-4、IL-5等炎症因子刺激气道分泌过量黏液、引发平滑肌痉挛并激活嗜酸性粒细胞聚集至气道周围，引发慢性炎症反应，肥大细胞受到刺激，释放存储的TNF-α，激活炎症细胞，加重炎症反应[11]。气道重塑与慢性炎症密切相关，可导致气道高反应，是肺功能损伤的病理标志之一，其涉及气道内多个组织及细胞异常变化，包括上皮细胞基底膜增厚、成纤维细胞增生、支气管壁增厚、管腔收缩及微血管面积增加等[12]。本研究结果显示，与BA组比较，Dio组LV、VE增加，IL-1β、TNF-α水平，MT%、MA%，肺组织病理损伤减轻，提示Dio可提升肺功能，减轻BA气道炎症反应及肺组织病理学变化，抑制气道重塑。Dio是甾体总皂苷的一种，现代药理学研究表明其具有增强机体免疫功能、抑制血小板聚集、增强心血管功能及抗肿瘤等功效，可用于甾体激素类药物合成[13]。Wu等[14]在研究小鼠肺炎模型时发现，Dio可通过抑制TNF-α、IL-1β水平，减轻炎症反应，抑制肺纤维化，从而治疗急性肺损伤，提示其在呼吸道疾病治疗中的抗炎效果，本研究结果与其具有部分相似性。

p38MAPK/NF-κB信号通路是机体重要的炎症及免疫通路，p38 MAPK、ERK是其级联反应调控因子，在细胞生长发育、增殖分化和凋亡等过程发挥重要作用[15]。NF-κB是核转录因子蛋白，可调节机体炎症及免疫反应。当机体进入应激状态后，p38 MAPK、NF-κB被激活发生磷酸化，由细胞质转移至细胞核内，促使相关基因转录，上调炎症因子表达，其级联反应信号刺激ERK1/2活化并聚集，诱发转录因子磷酸化，进一步促进炎症反应发生及发展[16]。有研究表明[17]，抑制p38MAPK/NF-κB信号通路可抑制小鼠肺组织炎症因子水平，减少黏液分泌，从而治疗小鼠过敏性鼻炎联合哮喘综合征，提示该通路在呼吸系统疾病中起到重要作用。本研究结果显示，与Control组比较，BA组肺组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2升高，经Dio干预后均降低，且在Dio基础上增用p38MAPK/NF-κB信号通路激活剂anisomycin可减弱Dio对BA的治疗作用，提示p38MAPK/NF-κB信号通路在BA中异常激活，Dio可能通过抑制该通路对BA幼鼠气道产生治疗作用。

综上所述，Dio可减轻BA幼鼠气道炎症反应，抑制气道重塑，可能与抑制p38MAPK/NF-κB信号通路有关。