甘蔗野生种割手密和大茎野生种的黑穗病抗性鉴定与评价

胡鑫，罗正英，赵培方，陆鑫，赵丽萍，刘洪博，吴转娣，赵勇，张静，任生林，吴才文，刘家勇

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南甘蔗遗传改良重点试验室，云南开远 661699）

0 引言

甘蔗是我国最主要的糖料作物，黑穗病是危害甘蔗生产的主要病害。目前我国蔗区普遍存在黑穗病，对蔗糖产业已造成了重大威胁[1-2]。甘蔗黑穗病菌可潜伏在甘蔗种茎内，难以用常规物理或化学方法清除，通常认为选用抗黑穗病甘蔗品种是防治黑穗病最为经济有效的方式。甘蔗属野生种是改良商业品种抗性的重要亲本来源，主要包括割手密（Saccharum spontaneum）和大茎野生种（S.robustum）。我国具有丰富的甘蔗野生种资源，也被认为是割手密的起源地之一[3-4]。据国家甘蔗种质圃统计，2010 年保存割手密资源624 份，占甘蔗属野生种资源的97%，占甘蔗属及甘蔗近缘属的67%[5]。早在19 世纪初，育种家通过“高贵化”策略将割手密与栽培种杂交，育成了突破性甘蔗品种‘POJ2878’和‘Co419’[6]。因此，发掘和利用优异抗黑穗病野生种质（特别是割手密）有可能带来甘蔗抗黑穗病育种的突破。

野生种黑穗病抗性鉴定与评价是育种创新利用的基础。ALEXANDER等[7]通过对热带种和割手密进行抗性评价，鉴定出一批高抗黑穗病割手密种质。BURNER等[8]对甘蔗属6个种的102个无性系开展抗黑穗病鉴定和评价研究，发现甘蔗近缘属野生种蔗茅和割手密抗病性最强，而最易感病的是热带种和大茎野生种，同时还发现不同来源割手密的黑穗病抗性有明显差异，其中印度割手密抗病性最强，其次是印度尼西亚割手密和菲律宾割手密。SAKAIGAICHI 等[9]通过鉴定30 份日本割手密种质的抗黑穗病性，结果表明人工接种后割手密黑穗病发病率分布范围为0～71%，抗性反应具有很大的变异。周耀辉等[10]针对海南育种场的割手密和斑茅进行抗黑穗病鉴定，结果表明割手密抗性水平变异度大，不同来源或者同一原产地割手密的抗病性均表现不同。杨李和[11]对云南割手密、斑茅、滇蔗茅后代黑穗病抗性进行研究，结果表明割手密种后代的黑穗病抗性表现优秀，能够显著改善传统感病种质的抗性。

本研究对25 份农艺性状优异的甘蔗野生种质进行黑穗病抗性鉴定与评价，旨在从中筛选优良抗病材料，为甘蔗品种抗黑穗病遗传改良提供优异种质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试甘蔗材料名称见表1，包括19 个割手密、6 个大茎野生种和3 个对照品种，对照品种分别为‘Q171’（高抗）、‘F134’（中抗）和‘新台糖22 号’（感病）；试验用种茎取自国家甘蔗种质资源圃。冬孢子于2019 年采自云南省红河哈尼族彝族自治州开远市蔗区‘新台糖22 号’，黑穗鞭子采后于室温自然风干4～5 d，用毛笔轻轻刮下鞭子上的冬孢子，充分混匀后分装于小滤纸袋中，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2 人工针刺接种鉴定

每个参试材料种茎砍成单芽段，接种前首先检测孢子萌芽率（大于90%），参考沈万宽方法[12]对参试材料茎芽进行针刺接种，黑穗病孢子浓度为5×106个/mL，接种菌液注射量以每株100µL。接种后材料种植于塑料桶（规格为直径40 cm，高25 cm，底径30 cm）里，每种植桶放8～10 芽，每个材料种植3 桶作为1 重复，共设3 重复。试验于2020年2 月桶栽于云南省农业科学院甘蔗研究所温室大棚中。温室条件为日温25～35 ℃，夜温13～20 ℃，空气湿度30%～65%，光强度540～900µmol/（m2·s）。整个生长季进行正常浇水、施肥管理，喷洒杀菌类农药。

1.3 试验数据收集与分析

从发生黑穗病株后定期调查基本苗数和发病株数，并将记录后的甘蔗黑穗病株连根拔除，以免再侵染。连续调查4个月，每次统计发病株数和总株数。计算累计茎发病率（IS）、病情发展曲线下面积(area under the disease-progress curve，AUDPC）和sAUDPC值[13]。其计算公式如下：

公式中，xi表示第i次调查的黑穗病发病率，ti表示第i次调查的时间。应用Excel 2007 和IBM SPSS Statistics 21 分析软件[14]对数据进行统计分析。按照国家甘蔗黑穗病抗性鉴定技术规程（GB/T35874-2018）进行抗性分级[15]。

2 结果与分析

2.1 参试材料发病情况分析

28份参试材料的发病情况如表1和图1 所示，2020 年参试割手密黑穗病发病率的分布范围为0～100%，平均发病率为43.0%，中位数为40%；2021 年参试割手密黑穗病发病率的分布范围为0～100%，平均发病率为35.1%，中位数为30%。2020 年参试大茎野生种黑穗病发病率的分布范围为0～83.3%，平均发病率为34.5%，中位数为30%；2021 年参试割手密黑穗病发病率的分布范围为0～87.5%，平均发病率为24.1%，中位数为10%。2020 年参试割手密AUDPC的分布范围为0～53.3，平均发病率为21.5，中位数为18；2021 年参试割手密AUDPC 的分布范围为0～78.1，平均发病率为26.6，中位数为20.8。2020 年参试大茎野生种AUDPC的分布范围为0～51.7，平均发病率为19.1，中位数为12.7；2021 年参试割手密AUDPC 的分布范围为0～68.4，平均发病率为17.3，中位数为8.0。

图1 割手密和大茎野生种的黑穗病发病分布情况Fig.1 Distribution of smut reaction in S.spontaneum and S.robustum

表1 28 份参试材料针刺接种后病情指数分析和抗病评价Table 1 Analysis of smut reaction on plant cane and 1st ratoon after pinprick inoculation

两个生长季对照品种‘Q171’和‘F134’的抗病等级一致，对照品种‘新台糖22 号’的抗病等级从9级变为8级，对照品种符合预期抗性水平，表明试验正常；两个生长季参试材料的抗病等级不完全一致，其中11份种质的抗病等级不变，12 份材料的抗病等级变小，2份种质的抗病等级变大。以发病等级高的鉴定结果为评价标准，评价结果为高抗（HR）的参试材料有3 个，分别为‘云农大2015-83’、‘NG77-004’和‘Q171’；抗病评价为抗病（R）的材料仅‘云南83-1-81’，被鉴定材料抗性以上占12%；抗病评价为中感（MS）的材料有5 个，分别为‘泰国SP2003-2’、‘广东35 号’、‘四川79-2-11’、‘51NG208’和‘51NG3’，占20%；抗病评价为感（S）的材料有10 个，分别为‘82-110’、‘广东韶关大茎割手密’、‘云瑞1-16’、‘开远割手密’、‘云南76-3-18’、‘广东55号’、‘云南82-29’、‘大野’、‘51NG63’、和‘F134’，被鉴定材料占36%；而抗病评价为高感（HS）的材料有9份，分别为‘越南1号’、‘88-22’、‘老挝2 号’、‘广东81号’、‘云南82-14’、‘云南蛮耗4 号’、‘广东31号’、‘福建大野’和‘新台糖22号’,被鉴定材料占32%。

2.2 2020和2021年抗黑穗病鉴定相关性分析

相关性分析结果如图2所示，2020年累积茎发病率（IS）与2021 年IS的相关性为0.8179，2020 年AUDPC值与2021年AUDPC相关系数为0.7977，sAUDPC值相关系数为0.7974。结果表明2年间参试材料抗黑穗病表现高度相关，抗性鉴定稳定性较好。综合2020 年和2021 年IS 与AUDPC 值进行相关分析，其相关系数为0.9434，表明IS与AUDPC值高度相关。

图2 黑穗病流行参数的相关分析Fig.2 Correlation analysis of smut epidemic parameters

2.3 参试材料聚类分析

依据参试材料2020 年与2021 年的IS、AUDPC 与sAUDPC 进行聚类分析。由于2020 与2021 年参试材料的IS、AUDPC与sAUDPC具有较高相关性，数据重叠影响聚类分析，先采用主成分分析提取主要特征值。结果如表2，大于1的主成分特征值仅为第一主成分λ1=5.379，方差贡献率达89.652%，因此选取λ1 能够代表最初的6个指标来分析参试材料的抗黑穗病水平。

表2 甘蔗黑穗病主成分分析Table 2 Principal component analysis of sugarcane smut disease

第一主成分对所有指标的载荷系数均大于0.9，因此第一主成分是对参试材料在新宿两季的黑穗病情流行病学的综合考量，可称之为“综合因子”。在综合因子中，IS_2020、AUDPC_2020、sAUDPC_2020、IS_2021、AUDPC_2021、和sAUDPC_2021 均具有较强作用。提取该指标进行系统聚类分析，结果如图3所示，28份参试材料按抗性水平可分为5类，第1类是‘云农大2015-83’、‘NG77-004’、‘Q171’、和‘云南83-1-81’共4个，两年平均发病率分布范围为0～3.6%，属于高抗种质；第2 类是‘51NG3’、‘泰国SP2003-2’、‘51NG208’、‘四川79-2-11’、‘云南76-3-18’、‘广东35号’、‘云瑞1-16’、‘广东韶关大茎割手密’、‘F134’、‘51NG63’和‘82-110’等共11 个，两年平均发病率范围为10.0%～34.2%；第3类是‘云南82-29’、‘云南蛮耗4 号’、‘大野’、‘广东55号’、‘广东31 号’和‘开远割手密’等共6 个，两年平均发病率范围为35.6%～43.1%；第4 类是‘云南82-14’、‘88-22’和‘老挝2 号’共3 个，两年平均发病率范围为63.0%～72.4%；第5 类是‘新台糖22 号’、‘福建大野’、‘越南1号’和‘广东81号’共4个，两年平均发病率范围为81.3%～95.0%。

图3 28份参试甘蔗种质的聚类分析Fig.3 The cluster result of 28 tested clones

3 讨论

本试验采用针刺接种所得出黑穗病发生率普遍较高，所有材料的平均发病率为36.7%，对照品种‘新台糖22号’的发病率达到81.3%。而熊国如等[16]和沈万宽等[17]结果显示‘新台糖22号’在浸渍接种方式下的黑穗病发病率分别为45%和40%，均明显低于本试验。沈万宽等[12]研究表明同一品种于注射接种后黑穗病发病率明显高于浸渍接种后的黑穗病发生率，其中‘新台糖22号’在浸渍接种下的黑穗病发病率为57%，而在注射接种后发病率大到75%，与本试验中‘新台糖22号’抗病反应较接近。OLWENY 等[18]报道针刺接种方式较浸渍接种方式更能提高甘蔗黑穗病发生机率。针刺接种打破了蔗芽对致病菌的物理屏障，有利于黑穗病菌成功侵染蔗芽生长点，因此该方式可能偏向于鉴定种质对黑穗病菌的内部抗性[19]。本试验比较了参试材料2年的IS和AUDPC值的相关性，结果表明两者间高度相关。通过主成分分析也发现IS、AUDPC和sAUDPC也是高度重叠，第1主成分特征值的方差贡献率达89.652%，因此在针刺接种方式下进行抗黑穗病鉴定选用其中一个指标即可以较好地评价种质的抗黑穗病。在浸渍接种方式中，阙友雄等[20]和李毅杰等[21]报道IS和AUDPC的相关系数分别为0.987和0.990。因此在两种不同接种方式下IS和AUDPC均极显著高度相关。

本试验对19个割手密和6 个大茎野生种进行抗黑穗病鉴定，结果表明割手密和大茎野生种的抗黑穗病均具有广泛的变异，在选择野生种质进行育种利用时不应忽视其抗黑穗病性。本试验中采用了甘蔗黑穗病抗性鉴定技术规程（GB/T 35874-2018）和系统聚类分析两种方法对野生种质进行评价，分别将参试材料分为5类和5级，各级材料的黑穗病发病率分布范围存在较大差异。GB/T 35874-2018 对4%～30%的发病区间细致划分为R、MR和MS三级，而该区间在聚类分析中均划分2类；聚类分析中将60%～100%的发病区间划分为第4 和第5类，而在GB/T 35874-2018 将该区间定义于HS。造成差异的原因可能是GB/T 35874-2018 多用于浸渍接种后抗病评价，参试材料的发病率可能较多分布于4%～30%区间，因此在此区间多划分等级有利于区别材料间的抗病反应差异。本试验采用针刺接种，材料的发病率较高，因而在对高发病区间多划分等级，实际工作中应该结合两种方法综合考量。

4 结论

通过针刺接种新宿试验，从25 份甘蔗野生种质中鉴定和筛选出3 份高抗种质，其中割手密2 份，分别为‘云农大2015-83’和‘云南83-1-81’；大茎野生种1份，为‘NG77-004’。这为甘蔗黑穗病抗性改良提供了优良亲本。此外，鉴定筛选出的高抗种质也可作为抗黑穗病供体来挖掘优良抗性基因，为将来抗黑穗病分子育种提供材料来源。