Box-Behnken响应面法优化厚朴温中汤提取工艺△

申若男，罗菊元，张晴，刘雪纯，胡文均，张泽康，王昌海，陆洋，2*，白洁*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.深圳北京中医药大学研究院，广东 深圳 518000

《内外伤辨惑论》中记载，厚朴温中汤是由姜厚朴、橘红、炙甘草、草豆蔻、木香、茯苓、干姜、生姜8 味中药组成[1]，功效主要为温中行气、燥湿除螨，现代临床上常用于治疗脾胃虚寒型胃痛等[2-3]。将经典名方开发为颗粒剂等现代制剂，不仅能推动经典名方的传承与发展，也能方便临床用药。

与传统中药新药研究以指标性成分最优为目的的工艺不同，在经典名方颗粒剂的制备工艺中，不是以参数值最大为目标，而是要保证关键质量属性符合基准样品质量标准的范围[4]。而指纹图谱、指标性成分、出膏率作为关键质量属性，需同时满足基准样品质量标准范围。

本研究制备了15 批厚朴温中汤基准样品对应实物，并确定了关键质量属性的范围。响应面法可以确定因素水平在其相应的范围之内[5]，使其最终得到的工艺参数符合基准样品质量标准范围。因此，本研究在单因素试验基础上，选择响应面法优化提取工艺，为后续现代制剂的开发研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

BSA 224S 型万分之一电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；JM-B100002 型十万分之一电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司）；KQ5200DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FD-2A 型真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；SHB-Ⅲ型循环真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；HH-6型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；UltiMate U3000型高效液相色谱仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；DZF-6051 型真空干燥器（北京利康达圣科技有限公司）。

1.2 试药

对照品厚朴酚（批号：110729-201714，纯度：100.0%）、橙皮苷（批号：110721-201818，纯度：96.2%）、甘草酸铵（批号：110731-201720，纯度：97.7%）、乔松素（批号：111829-201703，纯度：99.5%）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇、磷酸（Fisher 公司，色谱纯）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

姜厚朴饮片（批号：YP-HP-201801-2，产地：四川绵阳）；橘红饮片（批号：201920-4，产地：福建龙岩）；炙甘草饮片（批号：YP-GC-201804-1，产地：甘肃武威）；木香饮片（批号：YP-MX-DL-5，产地：云南大理）；草豆蔻饮片（批号：CDK-201804-5，产地：海南万宁）；茯苓饮片（批号：FL-201802-1，产地：安徽六安）；干姜饮片（批号：201802-1，产地：山东临沂）；生姜（批号：SJ-202009-5，产地：山东烟台），以上饮片均由亿帆医药股份有限公司提供，均经北京中医药大学刘春生教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 厚朴温中汤基准样品对应实物的制备

按厚朴温中汤处方量分别称取7味饮片最粗粉及生姜3片（总质量4～5 g）于陶瓷锅中，加入水300 mL，武火加热至沸腾后转文火煎煮30 min，以4层脱脂纱布作为滤材进行滤过，滤液放凉后调整至250 mL。精密移取水煎液5 mL 至西林瓶中，-20 ℃预冷冻24 h后转移至真空冷冻干燥机（-80 ℃，10 Pa），冷冻2 d，即得厚朴温中汤基准样品对应实物[6]。

2.2 橙皮苷、甘草酸、乔松素及厚朴酚含量测定方法的建立

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取适量的橙皮苷、甘草酸、乔松素、厚朴酚对照品，分别加甲醇定容至质量浓度分别为1040、1346、133、1070 μg·mL-1的对照品母液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取1 份冻干粉样品，加70%甲醇5 mL，超声15 min（200 W，40 kHz），摇匀后取样，用于测定橙皮苷、甘草酸、乔松素、厚朴酚含量。

按照处方量称取饮片，同法分别制备姜厚朴、草豆蔻、橘红、炙甘草阴性样品溶液。

2.2.3 色谱条件 Thermo Acclaim™120-C18120 Å（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～6 min，2%～7%A；6～10 min，7%～9%A；10～15 min，9%A；15～35 min，9%～13%A；35～40 min，13%A；40～54 min，13%～19%A；54～66 min，19%～29%A；66～103 min，29%～80%A；103～108min，80%A）；流速：1mL·min-1；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2.4 指标性成分含量测定方法学考察 根据《中华人民共和国药典》2020年版[7]，按照2.2.3项下色谱条件对橙皮苷、甘草酸、乔松素、厚朴酚进行含量测定方法学考察，结果见表1、图1～4。结果可以得出各考察指标均符合实验要求。

图1 厚朴温中汤中橘红饮片特征峰

表1 厚朴温中汤指标性成分含量测定方法学考察

2.3 基准样品出膏率的测定

按2.1项下方法制备基准样品后，取剩余水煎液样品245 mL 移入蒸发皿中，常压恒温水浴100 ℃浓缩至近干后，置减压真空干燥箱中60 ℃干燥24 h，得药材干膏，按公式（1）计算得出膏率。

图2 厚朴温中汤中炙甘草饮片特征峰

图3 厚朴温中汤中草豆蔻饮片特征峰

图4 厚朴温中汤中姜厚朴饮片特征峰

2.4 单因素试验初步筛选提取工艺

为客观反映各个因素对提取工艺的影响，以橙皮苷、甘草酸、乔松素、厚朴酚含量及出膏率为指标，并设立综合评分进行考察。按公式（2）计算综合评分。

固定提取时间为30 min，考察不同的加水量（300、600、900、1200 mL）及固定加水量600 mL，考察不同的提取时间（15、30、60、90 min）进行单因素试验，结果见表2～3。由表2可知，随着加水量的增加，指标性成分的含量、出膏率及综合评分增加渐缓，所以将响应面加水量高水平定为1200 mL；由表3 可知，随提取时间的延长，橙皮苷、甘草酸、乔松素及厚朴酚的含量增加渐缓，所以将提取时间高水平定为90 min。

表2 不同加水量对指标性成分质量分数、出膏率及综合评分的影响

表3 不同提取时间对指标性成分质量分数、出膏率及综合评分的影响

2.5 Box-Behnken法优化厚朴温中汤提取工艺

因厚朴温中汤处方中除炙甘草和茯苓外，其余药味均为芳香类中药，含小极性成分较多，其在水中溶解度较低，若直接测定厚朴温中汤水煎液，则样品中多个药味的特征峰无法得到体现。为了尽可能全面地反映厚朴温中汤样品的质量信息，参照基准样品水煎液测定前处理方法，采用冻干粉复溶后进样。

利用Design Expert 10 软件进行四因素三水平的27 次试验（中心点选择重复3 次），因素水平见表4。

表4 Box-Behnken响应面法优化厚朴温中汤提取工艺的四因素三水平试验设计

2.5.1 试验结果 27 组试验提取液冻干粉中的指标性成分含量和出膏率见表5。

表5 Box-Behnken响应面法优化厚朴温中汤提取工艺的试验设计与结果

2.5.2 模型的建立与评价 根据上述27 组的试验结果，采用二阶多项式模型进行方程拟合，回归方程：综合评分=0.77+0.067A -0.053B+0.14C+0.32D -0.062AB -0.043AC+0.20AD+0.057BC+0.073BD+0.37CD。对拟合模型进行ANOVA方差分析，由表6 可知，模型方差差异有统计学意义（P＜0.05）。失拟项是用来评估模型是否可靠的重要数据，本次模型的失拟项P值为0.383 6＞0.05，失拟值不显著，表明所建模型有统计学意义，可以较好地将模型与实际值拟合在一起[8]。模型相关系数为0.750 5，说明绝大部分响应值的变化均可由该模型来进行解释，可以运用该模型进行分析。

由表6 可知，因素C 的P＜0.05，说明提取时间对综合评分差异有统计学意义。且各影响因素之间还存在交互作用，不同交互因素与综合评分的响应面分析见图5～10。而因素D、CD 的P＜0.001，且图10 中响应面图坡度较陡，更加表明了提取时间和提取次数对综合评分有非常显著的影响。

图5 加水量和浸泡时间对厚朴温中汤最优提取工艺综合评分影响的响应面图及等高线图

表6 Box-Behnken响应面法预测厚朴温中汤最优提取工艺回归模型方差分析结果

2.5.3 预测最优工艺 经过预测得到的厚朴温中汤最优提取工艺为加水13.155 倍，浸泡32.486 min，提取30 min，提取3 次。此条件下的综合评分为0.486。根据实际情况为了方便后续实验，将工艺调整为加水13 倍（780 mL），浸泡30 min，提取30 min，提取3 次，验证优选工艺的可行性。

2.5.4 验证实验 按照预测的工艺参数进行验证实验，对结果进行综合评分，结果见表7。由表7 可知，按照预测工艺提取后，其结果均能接近预测值，甚至较响应面法预测值更低，同时可保证指标性成分橙皮苷、甘草酸、乔松素和厚朴酚的含量在基准样品值的70%～130%，更好地确保了制剂与基准样品质量的一致性。且验证实验与基准样品对应实物的对照图谱的相似度为0.999（图11），相似度良好。

图11 厚朴温中汤基准样品与验证实验图谱

表7 Box-Behnken响应面法优化预测厚朴温中汤最优提取工艺的验证实验结果

3 讨论

《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准的申报资料要求（征求意见稿）》指出，研究饮片到基准样品的量值传递关系应从指纹图谱、浸出物或特征图谱、含量测定等方面切入[9]。同样，在将经典名方制备为颗粒剂的过程中，也应比较研究基准样品与颗粒剂之间的量值传递关系，主要对基准样品指标性成分含量、特征图谱相似度及出膏率这3 个指标进行质量控制。

图6 加水量和提取时间对厚朴温中汤最优提取工艺综合评分影响的响应面图及等高线图

图7 加水量和提取次数对厚朴温中汤最优提取工艺综合评分影响的响应面图及等高线图

采用了层次分析法（AHP）确定综合评分时各个指标分配的比例，AHP 是一种非常方便、灵活的数学决策方法，具有多维准则。其充分利用了人类的经验和判断能力，将复杂的问题系统化、量化，从而对决策方案进行排序。AHP 主要将多个因素作为研究对象，每个因素又属于不同层次，具有递阶性[10]。厚朴温中汤主要有2 个层次：指标性成分和出膏率。姜厚朴为处方主药，厚朴酚作为姜厚朴中的主要药效成分且含量最高；乔松素是方中臣药草豆蔻的主要药效成分；橙皮苷是方中佐药橘红的主要药效成分；甘草酸是方中佐使药炙甘草的主要药效成分。在综合评分的比例分配上，由于各指标性成分在方中均起着重要作用，且出膏率也是作为衡量制剂质量的重要指标，所以对综合评分的评价设立了5 个占比相同的指标。

图8 浸泡时间和提取时间对厚朴温中汤最优提取工艺综合评分影响的响应面图及等高线图

图9 浸泡时间和提取次数对厚朴温中汤最优提取工艺综合评分影响的响应面图及等高线图

图10 提取时间和提取次数对厚朴温中汤最优提取工艺综合评分影响的响应面图及等高线图

以提取时间、浸泡时间、提取次数、加水量4 个因素作为响应面法中单因素试验的设计因素。随着时间的延长，有效成分也会逐渐被提取，再增加提取次数也难以较大地改变成分的含量[11]，所以直接将提取次数的3 个水平设定为1、2、3次。响应面法可以快速、有效地减少试验次数，规定各个指标均在其相应范围内并且可以更加直观地体现出各个因素之间的交互作用[12]。采用响应面法来优选提取工艺时，验证实验的结果均能达到预测值，表明该预测工艺能达到提取工艺的预期目标。最终确定的厚朴温中汤提取工艺：提取30 min，浸泡30 min，提取3 次，加水量780 mL。在此工艺条件下得到的厚朴温中汤制剂中指标性成分含量与基准样品对应实物含量相接近，且在70%～130%离散范围内，说明该工艺可行，可以作为后续实验中制剂的提取方法。