基于网络药理学与分子对接探讨芪苈强心胶囊治疗慢性心力衰竭的作用机制

骆睿翔，张 晨，吴 旸，崔 杰，范宗静

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是由于各种原因导致心脏结构或功能异常，继而引起心排血量减少的临床综合征[1]，具有患病率高、预后差的特点，是各种心脏疾病的终末阶段[2]。有研究显示，CHF患病率占全球人口的1%～3%，且呈逐年升高趋势[3]。有研究表明，CHF病人5年生存率与某些恶性肿瘤相当[4]。目前，西医治疗CHF主要应用利尿剂降低心脏负荷，血管紧张素转换酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ACEI/ARB)类药物逆转心室重构，β受体阻滞剂抑制交感神经兴奋，伊伐布雷定特异性抑制心脏窦房结起搏电流，洋地黄类药物抑制Na+/K+-ATP酶，进而抑制神经内分泌系统等[5]。但适应证局限，禁忌证繁多，可能产生一系列不良反应[6]。相比之下，中医治疗CHF显示出独特优势。

古代医籍中无关于CHF的命名，根据临床特征将其归属于“心水”“水肿”“心胀”“喘证”等范畴[7]。本病以心肾阳衰、血瘀饮停为主要病因病机，治疗以温阳化饮、化瘀利水为主[8]。芪苈强心胶囊是由11味药物组成的中药制剂，可提高CHF临床疗效，改善病人预后[9]。该药已被纳入《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》的临床推荐用药[10]。有研究表明，芪苈强心胶囊通过调节关键酶促使心肌细胞进行厌氧糖酵解，区域性地保留心肌细胞代谢的灵活性，从而保证能源效率而改善心力衰竭[11]。相关动物实验显示，芪苈强心胶囊可促进糖酵解，减轻大鼠心肌微血管内皮细胞损伤，改善心肌舒张功能[12-13]。多数研究仅从单一成分或通路进行探讨，而芪苈强心胶囊成分复杂，故治疗CHF的具体机制有待进一步阐释。

网络药理学具有系统性、整体性等特点，与中医“整体观念”的基本理论相似[14]，可全方位、多角度、多层次地展示中药复方治疗疾病的作用机制[15]。本研究旨在运用网络药理学方法探讨芪苈强心胶囊治疗CHF的潜在机制，以期为进一步开展相关基础研究与临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 芪苈强心胶囊化学成分及相应靶点的获取 借助中药系统药理学分析平台(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php/)[16]，获取芪苈强心胶囊中黄芪、人参、附子、丹参、葶苈子、泽泻、玉竹、桂枝、红花、香加皮、陈皮11味药的化学成分及相应蛋白靶点，通过限定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及类药性(drug likeness，DL)≥0.18对其有效成分进行筛选。利用UniProt数据库(https：//www.uniprot.org/)查询蛋白靶点对应的基因名称。通过中药分子机制综合数据库(TCMID)和中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)加以补充。

1.2 “中药-有效成分-靶点”网络的构建 将中药、有效成分及靶点基因导入Cytoscape 3.7.2软件，从而得到芪苈强心胶囊“中药-有效成分-靶点”相互作用的网络图。

1.3 CHF相关靶点的获取 借助人类基因数据库(GeneCards，https：//www.genecards.org/)和人类孟德尔遗传数据库(OMIM，https：//www.omim.org/)筛选CHF的疾病靶点，以“chronic heart failure”为关键词进行检索，合并检索数据并删除重复数据后得到CHF的相关靶点信息。

1.4 芪苈强心胶囊与CHF共同靶点韦恩图及蛋白-蛋白互作(PPI)网络的构建 将芪苈强心胶囊对应靶点和CHF相关靶点取交集后，得到芪苈强心胶囊和CHF的共同靶点，通过微生信在线作图平台(http：//www.bioinformatics.com.cn/)绘制出芪苈强心胶囊与CHF共同靶点的韦恩图。将共同靶点导入STRING数据库(https：//string-db.org/)，设定置信度为0.700(highest confidence)，并将游离靶点进行隐藏，其他参数不变，构建共同靶点蛋白的PPI网络图。

1.5 芪苈强心胶囊与CHF共同靶点的富集分析 将共同靶点导入Metascape数据库(https：//metascape.org/)，进行基因本体(Gene ontology，GO)功能富集分析，包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组成(cellular component，CC)3个部分；同时进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)通路富集分析，预测芪苈强心胶囊治疗CHF的可能机制。

1.6 分子对接验证 根据筛选出的活性成分和核心靶点，运用PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)获取相应靶点的蛋白结构，采用AutoDock Tools 1.5.6软件对其进行删除水分子、添加氢原子离配体和受体、计算电荷，输出保存为pdbqt格式；利用TCMSP数据库下载相应化合物的mol2结构文件并转换为pdb格式；运行AutoDock Vina[17]进行分子对接，评估靶点蛋白与化合物的结合情况；最后运用Pymol软件进行可视化分析。

2 结 果

2.1 芪苈强心胶囊成分及靶点的获取 借助TCMSP并根据OB≥30%及DL≥0.18，共筛选出芪苈强心胶囊有效成分209种，去除未查到靶点的成分，共得到158种有效成分，其中黄芪16种，人参17种，附子5种，丹参58种，葶苈子9种，泽泻7种，玉竹6种，桂枝6种，红花16种，香加皮13种，陈皮5种。利用UniProt数据库获取对应的基因靶点2 025个，其中黄芪347个，人参192个，附子22个，丹参646个，葶苈子246个，泽泻9个，玉竹29个，桂枝50个，红花352个，香加皮64个，陈皮68个，合并去重后最终获得基因靶点236个。

2.2 “中药-有效成分-靶点”网络的构建 结果表明：槲皮素、山奈酚、异鼠李素、毛蕊异黄酮、β-谷甾醇、人参皂苷Rh2、植物甾醇、黄芩素、β-胡萝卜素、木犀草素、丹参酮 ⅡA 、柚皮素等有效成分连接的靶点较多，详见表1。将11味中药、158种有效成分和236个靶点基因导入Cytoscape 3.7.2软件，得到芪苈强心胶囊的“中药-有效成分-靶点”相互作用的网络图，详见图1。其中节点(node)表示中药、有效成分和靶点基因，共405个；边(edge)表示相互作用关系，共2 183条；六边形代表中药、圆形代表有效成分、菱形代表靶点基因。由此预测上述成分可能是芪苈强心胶囊治疗CHF的主要活性成分。

表1 芪苈强心胶囊的核心成分

图1 “中药-有效成分-靶点”网络图

2.3 CHF相关靶点的获取 借助人类基因数据库(GeneCards，https：//www.genecards.org/)和人类孟德尔遗传数据库(OMIM，https：//www.omim.org/)筛选CHF的疾病靶点，以“chronic heart failure”为关键词进行检索，合并检索数据并删除重复值后，在 Excel中运用“MEDIAN”算法依次计算中位数，并依据大于中位数的标准进行筛选，最终保留CHF相关靶点1 296个。

2.4 芪苈强心胶囊与CHF共同靶点韦恩图及PPI网络的构建 将芪苈强心胶囊对应靶点236个和CHF相关靶点1 296个，取交集后得到共同靶点108个，并通过微生信在线作图平台绘制出芪苈强心胶囊与CHF共同靶点的韦恩图，详见图2。将108个共同靶点导入STRING数据库，将置信度设定为0.700(highest confidence)，并将游离靶点进行隐藏，其他参数不变，构建共同靶点蛋白的PPI网络图，其中节点表示蛋白，共108个；边表示相互作用关系，共460条，平均节点数为8.52，平均局部聚类系数为0.46，详见图3。将PPI网络图导入Cytoscape 3.7.2软件中以突出核心基因并进行可视化，选取Degree值排名居前12位的核心基因，分别为：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、白细胞介素6(IL6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮细胞生长因子(EGF)、胱天蛋白酶3(CASP3)、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、转录因子AP-1(JUN)、白细胞介素1B(IL1B)、基质金属蛋白酶9(MMP9)，详见图4。PPI网络筛选图见图5。

图2 芪苈强心胶囊与CHF共同靶点的韦恩图

图3 芪苈强心胶囊与CHF的PPI 网络图

图4 PPI网络核心基因

图5 PPI筛选网络图

2.5 GO功能富集分析 通过Metascape数据库对共同靶点进行GO富集分析，包括BP、MF、CC 3个部分，共富集507个条目，其中生物过程294条，分子功能111条，细胞组成102个。将排名居前10位的富集结果以弦图的方式可视化，详见图6～图8。结果表明：共同靶点主要参与对无机物的反应(response to inorganic substance)、积极调控细胞迁移(positive regulation of cell migration)、对有毒物质的反应(response to toxic substance)、对细胞外刺激的反应(response to extracellular stimulus)、血液循环(blood circulation)、对氧气水平的反应(response to oxygen levels)等生物过程；细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、转录因子结合(transcription factor binding)、蛋白质均二聚活性(protein homodimerization activity)等分子功能；膜筏(membrane raft)、囊泡腔(vesicle lumen)、质膜蛋白复合物(plasma membrane protein complex)等细胞组成。

图6 GO功能富集分析：“核心靶点-BP”弦图

图7 GO富集分析：“核心靶点-MF”弦图

图8 GO功能富集分析：“核心靶点-CC”弦图

2.6 KEGG通路富集分析 通过Metascape数据库对共同靶点进行KEGG富集分析，共富集112条信号通路。最终将富集显著的前20条通路以柱状图和气泡图的方式可视化，详见图9、图10。其中在癌症通路(pathways in cancer)、流体切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、丙型肝炎(hepatitis C)、TNF信号通路(TNF signaling pathway) 、缺氧诱导因子-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)6条通路富集较多。由此预测上述通路可能与芪苈强心胶囊治疗CHF关系密切。

图9 KEGG通路富集分析：“核心靶点-信号通路”柱状图

图10 KEGG通路富集分析：“核心靶点-信号通路”气泡图

2.7 分子对接结果 一般认为配体与受体结合能越低，结合越稳定，对接活性越大[18]。将芪苈强心胶囊中筛选出的10个关键活性成分和排名居前10位的核心靶点进行分子对接验证。分子对接结果显示，90%的靶心蛋白和对应的化合物分子结合能<-20.9 kJ/mol，表明核心靶蛋白和化合物分子有较好的结合性，详见图11。其中部分靶蛋白与化合物的结合力超过了原配体，表明这些化合物可能通过抑制原配体与靶点结合而发挥作用。选择排名最低的结合能绘制对接模型图，详见图12。

图11 芪苈强心胶囊核心成分与核心靶点蛋白对接热图

图12 9个结合能最低的分子对接模型图(A为MOL005344-人参皂苷Rh2-TNF；B为MOL000358-β-谷甾醇-TNF；C为MOL000449-植物甾醇-TP53；D为MOL005344-人参皂苷Rh2-MMP9；E为MOL007154-丹参酮ⅡA-EGF；F为MOL005344-人参皂苷Rh2-CASP3；G为MOL007154-丹参酮ⅡA-VEGFA；H为MOL000417-毛蕊异黄酮-VEGFA；I为MOL000354-异鼠李素-IL6)

3 讨 论

3.1 CHF与芪苈强心胶囊组方 中医学认为CHF属“心水”“水肿”“心胀”“喘证”等范畴。芪苈强心胶囊是基于中医脉络理论研发的治疗CHF的中成药，方中黄芪、附子为君药，人参、丹参、葶苈子为臣药，佐以红花、泽泻、陈皮、玉竹、香加皮，使以桂枝[19]。其中君药黄芪、附子益气温阳、利水消肿；臣药人参大补元气，丹参活血化瘀，葶苈子泻肺行水；佐药红花活血化瘀通络，泽泻、香加皮强心利水渗湿，陈皮调畅气机；使药桂枝引药入络。全方共奏益气温阳、活血通络、利水消肿之功。对于CHF，尤其是心肌梗死后心力衰竭的治疗效果显著[20]。

3.2 芪苈强心胶囊治疗CHF的潜在活性成分 通过分析得到芪苈强心胶囊的有效成分158种，主要包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素、β-谷甾醇、人参皂苷Rh2、黄芩素、β-胡萝卜素、木犀草素、丹参酮ⅡA、柚皮素等。槲皮素抗炎、抗氧化及抗凋亡的作用显著，通过增加内皮细胞一氧化氮(NO)的生物利用度，从而改善内皮细胞功能相关血管，同时保护心肌细胞[21]。山奈酚通过调节骨形态发生蛋白4(BMP4)信号通路和mRNA表达，抑制血管平滑肌细胞生成，进而预防血管重塑[22-23]。异鼠李素具有强大的心血管保护，抑制心肌细胞凋亡的作用[24]。β-谷甾醇和植物甾醇类似，具有抗炎、抗氧化、降脂等作用，可降低心血管事件发生率[25]。人参皂苷Rh2通过过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)δ-信号传导与转录激活因子3(STAT3)信号通路改善心肌纤维化，发挥保护心脏的作用[26]。黄芩素通过抑制Toll样受体4/核转录因子κB(TLR4/NF-κB)信号通路，延缓内皮细胞损伤，减轻氧化应激和炎症反应，对心肌缺血有一定的保护作用[27]。β-胡萝卜素可潜在调节循环胆固醇浓度，对妊娠期妇女心脏肥大起到调节作用[28]。木犀草素可调节NF-κB及Nfr2信号通路，激活抗炎及抗氧化反应[29]。丹参酮ⅡA通过单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)依赖性自噬途径，保护心肌梗死后心力衰竭，阻止甚至缓解心室重构[30-31]。柚皮素可抑制NF-κB p65的表达，减轻心肌细胞炎症反应；通过环磷酸鸟苷酸(cGMP)-cGMP依赖性蛋白激酶I(PKGI)信号传导减弱心肌缺血-再灌注损伤[32]。由此推测，芪苈强心胶囊的相关成分在治疗CHF过程中发挥了主要作用。

3.3 芪苈强心胶囊治疗CHF的关键作用靶点 通过PPI网络分析得到芪苈强心胶囊治疗CHF的关键作用靶点包括AKT1、IL6、VEGFA、TNF、EGF、CASP3、TP53、MAPK1、MAPK8、JUN、IL1B、MMP9等。AKT1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种，通过抑制AKT减轻心肌梗死后心力衰竭大鼠氧化应激反应，同时减轻心脏纤维化[33]。炎症反应是CHF发生发展的关键环节，IL6和IL1B均为免疫反应调节因子，其中IL6是这一环节的主要调控者[34-35]。VEGFA属于血管内皮生长因子，通过抑制冠状动脉内皮炎性因子表达，保护心肌细胞[36]。通过TNF途径可抑制心肌和内皮细胞凋亡[37]。CASP3的激活在细胞凋亡中发挥着核心作用，其是CHF病人心肌细胞代谢中的持续过程[38]。TP53是一种抑癌基因，通过调控炎症反应、细胞凋亡等影响CHF的发生和发展[39-40]。MAPK1与MAPK8均为丝裂原活化蛋白激酶，CHF的发生发展与MAPK蛋白磷酸化程度呈正相关，因此抑制MAPK蛋白磷酸化的过度表达是治疗CHF的重要途径[41]。JUN是转录因子AP-1家族的成员之一，适当抑制AP-1的表达，可延缓心肌肥厚及心肌细胞凋亡[42]。MMP9属于基质金属蛋白酶的一种，MMP可影响与心肌细胞和内皮细胞凋亡相关的心室重构，高水平MMP与CHF不良预后密切相关[43-44]。总之，芪苈强心胶囊可能通过调节AKT1、TNF、VEGFA、EGF等关键作用靶点，多途径发挥对CHF的治疗作用。

3.4 芪苈强心胶囊治疗CHF的核心信号通路 通过对共同靶点的KEGG富集分析，得到芪苈强心胶囊主要通过癌症通路、流体切应力与动脉粥样硬化、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、丙型肝炎、TNF信号通路、HIF-1信号通路等发挥对CHF的治疗作用。有研究表明，癌症通路可改变主要的心脏信号通路，促进心力衰竭的发展[45]。流体切应力是血流作用于血管内皮细胞的摩擦力，通过影响内皮细胞基因的表达，发挥抗炎、保护内皮细胞等作用，这一机制与心血管疾病的发生有内在联系[46]。TNF可触发NF-κB和MAPK等途径的激活，从而降低炎性因子水平，为CHF的治疗提供了新方向[47]。HIF-1是预防细胞缺氧的主要信号通路，通过调节多种基因如VEGF、GLUT4等调节氧气的输送[48]。有研究显示，芪苈强心胶囊通过调节HIF-1通路，可减轻心脏微血管内皮细胞缺氧诱导的损伤[49]。

3.5 分子对接 通过对有效活性成分、核心靶点进行分子对接，结果显示90%的核心成分与靶点间有较好的结合能力，其中VEGFA、TNF、MMP9与有效活性成分结合力显著，表明芪苈强心胶囊通过多药物、多靶点协同发挥作用。

综上所述，基于网络药理学方法预测芪苈强心胶囊中槲皮素、山奈酚、异鼠李素、毛蕊异黄酮、β-谷甾醇、人参皂苷Rh2、植物甾醇、黄芩素、β-胡萝卜素、木犀草素、丹参酮ⅡA、柚皮素等活性成分通过AKT1、IL6、VEGFA、TNF、EGF、CASP3、TP53、MAPK1、MAPK8、JUN、IL1B、MMP9等关键靶点调节癌症通路、流体切应力与动脉粥样硬化、TNF、HIF-1等信号通路，进而发挥对CHF的治疗作用。分子对接技术验证了有效活性成分与核心靶点具有较好的结合活性。初步证实了芪苈强心胶囊治疗CHF具有多成分、多靶点、多通路的特点，有利于进一步开展相关基础研究与临床应用。