细叶黄皮根总黄酮提取工艺优化及抑菌活性研究

许丹妮 苏秀芳 黄丽娟

(广西民族师范学院化学与生物工程学院，广西 崇左 532200)

细叶黄皮[Clausenaanisum-olens(Blanco.) Merr]为芸香科黄皮属植物。据报道，细叶黄皮植物含有香豆素[1]、黄酮类[2]、挥发性成分[3]等，其中黄酮类成分含量较高。苏秀芳等[4-5]分别从细叶黄皮果仁、叶提取总黄酮，并测定其清除羟自由基活性，表明总黄酮具有较强的清除羟自由基的能力。另外，苏秀芳等[6]研究发现，细叶黄皮茎皮乙醇提取物具有广谱的抑菌活性。

为进一步考察细叶黄皮其他部位总黄酮含量，以及不同产地细叶黄皮总黄酮含量及抑菌情况，研究拟优化细叶黄皮根总黄酮的超声辅助提取工艺，并对广西崇左市不同地区细叶黄皮根提取物的抑菌活性进行测定，以期为细叶黄皮资源的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

紫外可见分光光度计：UV-1601型，北京瑞利分析仪器公司；

超声波清洗器：SG2200HPT型，上海冠特超声仪器有限公司；

立式电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-50KBS型，上海申安医疗器械厂；

隔水式恒温培养箱：GNP-9270型，上海精寄宏实验设备有限公司。

1.2 材料

绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureu)：广东微生物研究所；

大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、杀螟杆菌(Bacilluscereus)：广西大学农学院；

芦丁：生化试剂，上海晶纯试剂有限公司；

琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨：广东环凯微生物有限公司。

1.3 样品

细叶黄皮于2020年5月采摘于崇左市郊区、扶绥县东门镇、宁明县亭亮乡、龙州县响水镇、天等县东平乡、大新县雷平镇，经该院植物分类学黄秋婵教授鉴定为Clausenaanisum-olens。取各产地细叶黄皮根烘干，粉碎，过60目筛备用。

1.4 方法

1.4.1 标准品溶液的制备 准确称取芦丁标准品12.50 mg，用60%乙醇溶解并定容，配制成芦丁标准液0.250 0 g/L。

1.4.2 测定波长的选择 取1 mL芦丁标准品溶液，用5% NaNO2水溶液0.4 mL溶解，放置6 min，再用10% Al(NO3)3水溶液0.4 mL溶解，放置6 min，最后用4% NaOH水溶液4.0 mL溶解并定容，室温放置15 min后，用400～600 nm范围扫描最大吸收波长，结果在510 nm处有最大吸收峰，以510 nm作为测定波长。

1.4.3 标准曲线的绘制 取5只比色管，分别准确吸取0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mL芦丁标准品溶液，其他步骤同1.4.2，以试剂空白为对照，测定样品的吸光度。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=9.485 7ρ-0.003 1，R2=0.999 6，在考察范围内呈良好的线性关系。

1.4.4 单因素试验 以细叶黄皮根总黄酮得率为考察指标，大新县雷平镇细叶黄皮根为原料通过超声辅助提取法探讨不同提取条件对总黄酮得率的影响。

(1) 温度对总黄酮得率的影响：称取物料1.000 g，加60%乙醇20 mL，设定功率50 W，超声提取20 min，滤纸过滤，定容至50 mL，准确吸取1 mL样品按1.4.3处理，测定吸光度后计算总黄酮得率。探讨温度为30，40，50，60，70，80 ℃对细叶黄皮根总黄酮得率的影响。

(2) 超声功率对总黄酮得率的影响：称取物料1.000 g，加60%乙醇20 mL，分别设定超声功率40，50，60，70，80 W，超声提取20 min，过滤，定容，准确吸取1 mL 样品按1.4.3处理，测定吸光度后计算总黄酮得率。

(3) 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响：称取物料1.000 g，温度70 ℃，功率60 W，设定乙醇体积分数为40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，分别量取20 mL，提取20 min，过滤，定容，准确吸取1 mL样品按1.4.3处理，测定吸光度后计算总黄酮得率。

(4) 液料比对总黄酮得率的影响：称取物料1.000 g，设定温度70 ℃，功率60 W，乙醇体积分数90%，改变液料比1∶8，1∶12，1∶16，1∶20，1∶24，1∶28 (g/mL)，提取20 min，过滤，定容，准确吸取1 mL样品按1.4.3处理，测定吸光度后计算总黄酮提取率。

(5) 提取时间对总黄酮得率的影响：称取物料1.000 g，设定温度70 ℃，功率60 W，乙醇体积分数90%，液料比1∶24 (g/mL)，改变提取时间为20，30，40，50，60，70 min，过滤，定容，准确吸取1 mL样品按1.4.3处理，测定吸光度后计算总黄酮得率。

1.4.5 正交试验 根据单因素试验结果，选取L9(34)正交表进行试验设计，优化提取工艺并进行重复性验证实验，以最佳工艺条件测定不同产地细叶黄皮根总黄酮得率。

1.4.6 抑菌试验

(1) 抑菌受试液的制备：分别取崇左市6个不同产地的细叶黄皮根总黄酮，配制成一定浓度受试液。

(2) 菌液的制备：用供试菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在约37 ℃摇床活化18 h，用10倍稀释法稀释菌悬液并进行活菌计数，使最佳菌悬液浓度约为106CFU/mL。

(3) 倾注平板法测定抑菌效果：根据文献[7]修改如下，用移液枪吸取受试液各2 mL，分别放于直径约9 cm的无菌空培养皿内，加入预先融化冷却好的琼脂培养基，混匀；移取配置好的菌液100 μL，放入相应的培养皿中，均匀涂布，于37～39 ℃恒温培养，24 h后观察结果，量出抑菌圈。

1.5 数据分析

试验数据均为3个平行样的均值，采用Excel 2010处理数据、绘图并进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 温度对细叶黄皮根总黄酮得率的影响 由图1可知，细叶黄皮根总黄酮得率在30～60 ℃时呈平缓上升趋势，温度为70 ℃时总黄酮得率最大，随后出现下降，推测随着温度的增加，分子运动速率增加，加速了黄酮类成分向细胞外的溶出[8]。因此最佳提取温度为70 ℃。

图1 温度对总黄酮得率的影响

2.1.2 超声功率对细叶黄皮根总黄酮得率的影响 由图2 可知，在超声功率为50 W时细叶黄皮根总黄酮得率达到最大值，而后逐渐下降，可能是由于受到“空化作用”[9]的影响，某些黄酮类物质结构受到破坏，因而影响总黄酮得率。因此最佳提取功率为50 W。

图2 超声功率对总黄酮得率的影响

2.1.3 乙醇体积分数对细叶黄皮根总黄酮得率的影响

由图3可知，细叶黄皮根总黄酮得率随乙醇体积分数的增加呈先升高后降低的趋势，当乙醇体积分数为90%时得率最高，达3.1%。这可能是随着乙醇体积分数的增加，有其他杂质溶出并与乙醇—水分子结合，导致总黄酮得率降低[10]。因此最佳提取的乙醇体积分数为90%。

图3 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

2.1.4 料液比对细叶黄皮根总黄酮得率的影响 由图4可知，细叶黄皮根总黄酮得率在料液比为1∶24 (g/mL)时达到最大值3.12%，推测溶剂量增加，在超声作用下料液之间混合较充分，同时使植物细胞破裂，溶剂迅速进入细胞内，促使黄酮类化合物不断溶出，直至达到饱和。因此最佳提取的料液比为1∶24 (g/mL)。

图4 料液比对总黄酮得率的影响

2.1.5 提取时间对细叶黄皮根总黄酮得率的影响 由图5 可知，细叶黄皮根总黄酮得率随提取时间的增加先增加后降低并趋于平缓，当提取时间为40 min时得率达到最大值，为3.17%。推测在合适的提取时间范围，超声波能促进总黄酮类成分的溶出，而随提取时间的延长，总黄酮类成分溶出完全，同时有可能溶出的黄酮类化合物反而被超声所破坏，导致总黄酮得率下降[11]。因此最佳提取时间为40 min。

图5 提取时间对总黄酮得率的影响

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验因素 正交试验因素水平设计见表1，试验结果与极差分析见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交试验因素水平表

由表2和表3可知，细叶黄皮根总黄酮得率的主次影响因素为料液比>超声功率>提取时间>乙醇体积分数(C>B>D>A)，其中料液比、超声功率对总黄酮得率具有显著性影响；最佳提取工艺条件为A2B2C1D2，即乙醇体积分数90%，超声功率50 W，料液比1∶16 (g/mL)，提取时间40 min。

表2 试验结果与极差分析

表3 方差分析结果†

2.2.2 验证实验 准确称取3份试样，按最佳提取工艺条件提取，总黄酮得率分别为3.346%，3.380%，3.356%，平均值为3.361%，表明此工艺重复性好，具有可行性。

2.3 不同产地细叶黄皮根提取物得率比较

称取各个产地的细叶黄皮根1.000 g，按最佳提取工艺提取，结果见表4。由表4可知，崇左市区细叶黄皮根皮提取总黄酮得率最高，其次是大新县雷平镇。

表4 不同产地总黄酮的得率

2.4 不同产地细叶黄皮根提取物抑菌活性比较

取不同产地细叶黄皮根提取物，低温回收溶剂后，低温烘干后加入二甲亚砜(经试验表明其对供试菌无抑制作用)，配成质量浓度100 mg/mL，为受试液，进行抑菌试验，结果见表5。

表5 不同产地细叶黄皮总黄酮抑菌圈直径

由表5可知：不同产地细叶黄皮根提取物对5种菌均有一定的抑制作用，不同产地提取物的抑菌效果不同，但同一产地的提取物对5种菌的抑制效果差异不明显。整体分析6个产地中崇左市区、大新县雷平镇细叶黄皮根提取物抑菌作用相对较强，次之为龙州县响水镇，天等县东平乡、宁明细叶黄皮提取物抑菌效果相对较弱。其原因可能是不同产地细叶黄皮根提取物的总黄酮含量不同，影响了其对5种试验菌的抑制作用。

3 结论

通过超声辅助提取细叶黄皮根总黄酮得率为3.361%，不同产地细叶黄皮根总黄酮提取得率有差异，崇左市区细叶黄皮根皮总黄酮得率达4.781%，其次是大新县雷平镇总黄酮得率为3.361%，超声波辅助提取法简便、省时，适合用于细叶黄皮根总黄酮的提取，推测不同产地，不同土壤、不同气候环境对细叶黄皮根总黄酮得率有一定的影响，而不同产地细叶黄皮根或根皮总黄酮对杆菌类(绿脓、枯草、杀螟、大肠)及金色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌广谱，且不同产地抑菌效果不同。综合分析，细叶黄皮利用价值高，应对各产地相同部位的有效成分及生物活性等进一步深入研究，筛选出最佳的产地并进行大量种植，使其在食品行业中发挥更广的作用。