木犀草素对结肠癌细胞生长的影响及作用机制研究

杨 悌, 张代玲, 万启军, 张 颖, 高玉录

(江苏省昆山市中医院 检验科, 江苏 昆山, 215300)

结肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均呈逐年上升趋势，严重危害患者的健康与生命安全[1]。手术治疗仍是结肠癌的主要治疗手段，而放疗、化疗等辅助治疗方法可进一步改善患者预后，但结肠癌晚期复发及远处转移患者的治疗效果不佳，易导致预后不良[2]。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎等活性，能抑制多种肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡，可用作放疗、化疗患者的辅助药物，增敏肿瘤细胞对相关治疗的敏感性[3-4]。目前，关于木犀草素对免疫细胞影响的研究较少，木犀草素是否通过影响免疫细胞活性进而参与肿瘤生长抑制尚未明确。本研究以人和小鼠结肠癌细胞系以及小鼠荷瘤模型为研究对象，探讨木犀草素对免疫细胞活性和结肠癌细胞生长的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞系

8～10周龄雌性C57BL6小鼠，购自南京大学模式动物研究所; 小鼠结肠癌细胞系MC-38、CT-26、CMT-93, 人结肠癌细胞系Caco-2, 均购自中科院上海细胞库。所有体外培养细胞均在RPMI 1640或DMEM培养基(含10%胎牛血清及青链霉素)中于37 ℃、5%CO2湿润环境培养。

1.2 实验材料

细胞增殖检测CCK-8试剂盒，细胞分裂检测试剂羧基二乙酸荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFSE)，细胞凋亡检测试剂盒(AnnexinV-PI), 乳酸脱氢酶(LDH)释放检测试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司，试剂盒使用方法均参照试剂盒说明书。

1.3 结肠癌细胞增殖、凋亡、迁移检测方法

将小鼠和人结肠癌细胞培养至对数期，分别于96孔板中铺板(每孔104个细胞)，分别加入不同浓度木犀草素(1、5、10、20 μmol/L)并设置溶剂对照(0 μmol/L)后于培养箱中培养24 h。CCK-8细胞增殖实验: 直接向培养体系中加入CCK-8细胞增殖检测试剂继续培养4 h后，于波长490 nm处检测光密度(OD)值。细胞凋亡实验: 对培养细胞进行膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)染色后以流式细胞仪检测细胞凋亡率，其中5-氟尿嘧啶(5-FU)为细胞凋亡诱导阳性对照。CFSE细胞分裂能力检测实验: 首先对培养细胞进行CFSE标记，加入不同浓度木犀草素后于培养箱中培养24 h, 采用流式细胞仪检测CFSE荧光强度变化。细胞迁移能力(划痕实验)检测: 将细胞培养至对数期后铺于6孔板中(每孔106个细胞)，待细胞完全铺满板底后对细胞进行划线，以培养基冲洗细胞去除悬浮细胞后加入不同浓度木犀草素后于培养箱中培养24 h, 分别于0、24 h时点观察划痕汇合情况。

1.4 小鼠荷瘤模型构建及实验方法

将小鼠结肠癌细胞系MC-38培养至对数期，细胞计数后于每只小鼠背部皮下接种106个细胞，构建小鼠荷瘤模型。木犀草素组6只小鼠接受腹腔注射木犀草素20 mg/kg治疗(每2 d注射1次)，对照组6只小鼠接受相同剂量溶剂注射干预(每2 d注射1次)。待小鼠成瘤后，测量小鼠肿瘤大小，并计算肿瘤体积(计算公式为体积=长×宽2/2), 绘制肿瘤生长曲线。于成瘤后21d解剖小鼠，取肿瘤组织进行称重。小鼠存活实验(每组5只小鼠)成瘤方法同上，每天观察记录小鼠肿瘤生长及其存活状况，绘制小鼠存活曲线。

1.5 流式细胞术检测方法

抗小鼠荧光抗体CD3(17A2)、CD8(53-6.7)、CD4(GK1.5)、NKG2D(CX5)、NK1.1(PK136)、CD69(H1.2F3), 抗人荧光抗体CD8(OKT8)、NKG2D(1D11)、CD69(FN50), 细胞内因子检测及破膜染色试剂盒，细胞激活剂均购自ThermoFisher公司。将小鼠脾脏单细胞悬液或人外周血单个核细胞(PBMC)分别以不同浓度木犀草素(0、1、5、10、20 μmol/L)刺激24 h, 加入相应荧光抗体, 4 ℃染色30 min后，采用BD FACSVerse流式细胞仪检测并进行数据分析。

1.6 细胞杀伤活性检测方法

将CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞分别与靶细胞(MC-38)以3∶1、1∶1、1∶3比例混合共培养，于共培养体系中加入不同浓度(0、5、10 μmol/L)木犀草素和高尔基体转运阻断剂后于培养箱培养4.5 h。分别加入相应荧光抗体(CD8-CD107a、NK1.1-CD107a), 4 ℃染色30 min后，采用BD FACSVerse流式细胞仪检测并进行数据分析。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 木犀草素对结肠癌细胞系的影响

CCK-8法检测结果显示，与0 μmol/L木犀草素比较，小鼠结肠癌细胞系MC-38、CMT-93的OD490 nm在10、20 μmol/L木犀草素作用下均降低，小鼠结肠癌细胞系CT-26的OD490 nm在5、10、20 μmol/L木犀草素作用下均降低，人结肠癌细胞系Caco-2的OD490 nm在20 μmol/L木犀草素作用下降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01), 见图1。由此表明，木犀草素在5 μmol/L浓度下即可显著抑制小鼠结肠癌细胞系CT-26增殖, 10 μmol/L浓度即可显著抑制小鼠结肠癌细胞系MC-38、CMT-93增殖。

A: 小鼠结肠癌细胞系MC-38; B: 小鼠结肠癌细胞系CT-26; C: 小鼠结肠癌细胞系CMT-39; D: 人结肠癌细胞系Caco-2。与0 μmol/L比较, *P<0.05, **P<0.01。图1 不同浓度(0、1、5、10、20 μmol/L)木犀草素对结肠癌细胞系增殖的影响

CFSE细胞分裂能力检测实验结果显示, 5、10、20 μmol/L木犀草素作用下的分裂细胞百分率均低于0 μmol/L木犀草素，差异有统计学意义(P<0.01), 见图2, 表明木犀草素可显著抑制小鼠结肠癌细胞系CT-26分裂，且呈浓度依赖性。

A: CFSE检测不同浓度木犀草素对小鼠结肠癌细胞系CT-26分裂的影响; B: 分裂细胞百分率统计结果(与0 μmol/L比较, **P<0.01)。图2 不同浓度(0、1、5、10、20 μmol/L)木犀草素对结肠癌细胞分裂的影响

小鼠结肠癌细胞系CT-26凋亡实验结果显示，随着木犀草素浓度的升高，凋亡细胞百分率升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01), 见图3, 表明木犀草素可促进结肠癌细胞的凋亡。

A: 流式细胞术检测不同浓度木犀草素对小鼠结肠癌细胞系CT-26凋亡的影响(5-FU为细胞凋亡诱导阳性对照); B: 凋亡细胞百分率结果(与0 μmol/L比较, *P<0.05, **P<0.01)。图3 不同浓度(0、1、5、10、20 μmol/L)木犀草素对结肠癌细胞凋亡的影响

细胞划痕实验结果显示，木犀草素可显著抑制小鼠结肠癌细胞系MC-38的迁移能力，见图4。

图4 细胞划痕实验检测不同浓度木犀草素对小鼠结肠癌细胞系MC-38迁移的影响

2.2 木犀草素治疗对小鼠移植瘤生长的影响

构建小鼠结肠癌细胞系MC-38移植瘤模型探讨木犀草素治疗对肿瘤生长的影响，结果显示，木犀草素组荷瘤小鼠成瘤21 d的肿瘤体积与肿瘤质量均大于对照组，差异有统计学意义(P<0.01), 且木犀草素组小鼠的生存率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05), 见图5。由此表明，木犀草素治疗可显著抑制小鼠MC-38结肠癌移植瘤的生长，并可延长小鼠的生存期。

A: 2组荷瘤小鼠肿瘤生长曲线(n=6); B: 2组荷瘤小鼠肿瘤组织质量(n=6); C: 2组荷瘤小鼠生存曲线(n=5)。2组间比较, *P<0.05, **P<0.01。图5 小鼠结肠癌细胞系MC-38荷瘤小鼠模型肿瘤生长及生存曲线

2.3 木犀草素对小鼠免疫细胞活性的影响

为探索木犀草素对免疫细胞活性的影响，本研究采用不同浓度木犀草素体外刺激小鼠免疫细胞，观察小鼠脾脏淋巴细胞增殖及表面活化分子表达情况。结果显示，1、5、10、20 μmol/L木犀草素对小鼠淋巴细胞增殖均有抑制效应，但与0 μmol/L木犀草素比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见图6; 不同浓度木犀草素对CD4+T细胞、CD8+T细胞表面活化型分子CD69表达的影响比较，差异无统计学意义(P>0.05), 说明木犀草素对小鼠淋巴细胞活化无直接影响; 相较于0 μmol/L木犀草素，1、5、10、20 μmol/L木犀草素均使CD8+T细胞、NK细胞表面NKG2D表达上调，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01), 见图7, 提示木犀草素可能上调CD8+T细胞和NK细胞对肿瘤的杀伤能力。进一步采用LDH释放法检测小鼠CD8+T细胞和NK细胞经木犀草素刺激后对MC-38、Yac-1细胞的杀伤能力，结果显示，当效靶比为3∶1时，相较于0 μmol/L木犀草素, 10 μmol/L木犀草素可上调CD8+T细胞和NK细胞对靶细胞的杀伤活性，差异有统计学意义(P<0.05), 见图8。

图6 不同浓度木犀草素对小鼠脾脏细胞增殖的影响

A: CD4+T细胞、CD8+T细胞表面CD69表达; B: CD8+T细胞、NK细胞表面NKG2D表达; C: 细胞表面分子表达频率统计结果(与0 μmol/L比较, *P<0.05, **P<0.01)。图7 不同浓度木犀草素对小鼠脾脏细胞表面分子表达的影响

A: CD8+T细胞杀伤能力检测; B: NK细胞杀伤能力检测。与0 μmol/L比较, *P<0.05。图8 木犀草素对小鼠脾脏CD8+T细胞和NK细胞杀伤能力的影响

2.4 木犀草素对人T细胞活化的影响

为明确木犀草素对人外周血淋巴细胞活性的影响，本研究分离健康个体PBMC, 在体外以不同浓度木犀草素处理后检测CD8+T细胞表面活化分子CD69、NKG2D表达情况。结果显示，相较于0 μmol/L木犀草素，1、5、10、20 μmol/L木犀草素体外刺激均可上调人外周血CD8+T细胞表面CD69、NKG2D表达，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01), 见图9。

A: CD8+T细胞表面CD69、NKG2D分子表达情况; B: 阳性细胞百分率统计结果(与0 μmol/L比较, *P<0.05, **P<0.01)。图9 不同浓度木犀草素对人外周血CD8+T细胞表面活化分子表达的影响

3 讨 论

木犀草素具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和干扰肿瘤代谢的能力[5-6]。本研究分析了不同浓度木犀草素对人和小鼠结肠癌细胞系增殖、凋亡的影响，发现木犀草素可抑制多种结肠癌细胞系的增殖，并可促进结肠癌细胞凋亡，但在不同结肠癌细胞系中，木犀草素抑制细胞增殖的效应存在差异，说明不同结肠癌细胞对木犀草素的敏感性可能不同。

NK细胞是抗肿瘤免疫的第一道防线，而CD8+T细胞是抗肿瘤免疫应答的核心环节[7], 其中NKG2D对固有免疫和获得性免疫均具有调控作用，是抗肿瘤免疫应答的活化型受体，其在免疫细胞的表达情况受到临床广泛关注[8-9]。本研究检测木犀草素对小鼠、人T细胞与NK细胞表面活化型分子CD69、NKG2D的影响结果发现，木犀草素对免疫细胞增殖及活化无影响，但可显著上调CD8+T细胞及NK细胞表面NKG2D表达，提示木犀草素的抗肿瘤效应可能与激活免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力相关。相关报道[10]显示，多种天然黄酮类化合物可通过影响免疫细胞的活性参与肿瘤等相关疾病的发生与进展，因此，深入探讨木犀草素对免疫细胞活性及功能的影响，可为进一步研究木犀草素在临床相关疾病治疗中的作用机制提供理论依据。

综上所述，木犀草素可抑制结肠癌细胞生长，促进结肠癌细胞凋亡，抑制移植瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存期，还可增强免疫细胞活性而抑制肿瘤生长。