CD16+单核细胞变化与强直性脊柱炎的相关性研究

于 淼，杨 林，李伟静，宋 宇，王玉辉，王 旭，郑亮亮，宋玉国，

(1.北华大学医学技术学院，吉林 吉林 132013；2.北华大学基础医学院，吉林 吉林 132013；3.北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)

血液中的单核细胞(Monocyte)来源于髓系前体细胞，既是机体固有免疫的重要组成细胞，又是一类重要的抗原提呈细胞，在特异性免疫应答的诱导与调节中发挥着关键作用.有研究[1]发现：单核细胞是存在高度异质性的细胞群体，发挥不同作用的细胞其表面标志是不完全相同的.CD14分子是单核细胞表面重要的分化抗原，表达于成熟单核细胞表面；CD16分子是单核细胞表面Fc受体的一个亚类(FcγRⅢ).根据CD14和CD16表达强度的不同，可将单核细胞分为经典型单核细胞(CD14brightCD16-)、中间型单核细胞(CD14brightCD16+)和非经典型单核细胞(CD14dimCD16+)[1].本研究应用多参数流式细胞技术，建立了单核细胞亚型检测方法，重点探讨检测CD16+单核细胞的临床应用价值，并应用在常见的自身免疫病——强直性脊柱炎(Ankylosing spond- ylitis，AS)患者的诊治中.AS是脊柱关节炎(Spondy- loarthritis，SpA)中常见的临床疾病类型，AS的致病因素较多，自身免疫功能紊乱是介导AS发病的重要因素，外周血单核细胞亚型及其相关细胞因子参与其发病过程[2-3].其中，CD16+单核细胞(包括CD14brightCD16+和CD14dimCD16+单核细胞)在类风湿性关节炎(RA)[4-7]、人类炎症性肠病(IBD)[8]、溃疡性结肠炎(UC)[9]以及银屑病性关节炎(PsA)[10]等许多自身免疫性疾病的进程中发挥了重要作用.单核细胞亚型检测仅仅是对细胞表型进行检测分析，其具体作用机制要通过表达细胞因子等方面进行功能分析.本研究应用流式细胞技术同步检测了血浆相关细胞因子，并进行了初步相关性分析.

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 研究对象

选择2018年10月—2020年10月北华大学附属医院风湿免疫科强直性脊柱炎患者50例(AS组)，其中，男35例，女15例，男女比为7∶3；年龄21～74岁，平均(43.24±15.01)岁.AS诊断是基于修改后的纽约标准[11]，AS患者通过流式细胞分析仪(FCM)检测HLA-B27[12]为阳性.健康对照组40例，来自北华大学附属医院健康检查中心，其中，男26例，女14例，男女比13∶7，年龄21～79岁，平均(45.15±18.17)岁，经FCM检测HLA-B27为阴性.AS组和对照组在年龄、性别和其他自然条件上具有可比性，招募患者的临床特征在组间无任何基线差异.

1.1.2 主要仪器和试剂

流式细胞仪(NAVIOS型，贝克曼库尔特公司，美国)；荧光标记的单克隆抗体CD14-PE、CD16-FITC和HLA-DR-PEcy5(贝克曼库尔特公司，美国)；人血浆细胞因子TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN -γ检测试剂盒(深圳唯公生物科技有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 标本采集

采用EDTA-K2抗凝真空采血管采集静脉血2 mL.取抗凝全血100 μL用于流式细胞技术检测单核细胞亚型；其余全血3 000 r/min离心10 min，分离上层血浆用于细胞因子检测.

1.2.2 流式细胞术检测外周血CD16+单核细胞及相关亚型

将10 μL CD14-PE和10 μL CD16-FITC标记的单克隆抗体加入流式细胞仪专用试管中，再加入100 μL抗凝全血，室温避光标记15 min，再将红细胞溶解，应用流式细胞仪进行检测.以CD16-FITC为横坐标、CD14-PE为纵坐标建立流式细胞仪检测方案，检测并记录经典型单核细胞(CD14brightCD16-)、中间型单核细胞(CD14brightCD16+)和非经典型单核细胞(CD14dimCD16+)的百分率，重点分析后两者CD16+单核细胞的变化情况.

1.2.3 流式细胞术定量检测血浆相关细胞因子含量

定量校准品制备：准备8个1.5 mL离心管作为校准品梯度管，标记编号0～7；7号管留空，1号管中加入50 μL缓冲液，其他6管中加入150 μL缓冲液.向校准品瓶中加入0.5 mL缓冲液，充分溶解混匀并转移至7号管，为最高浓度校准液；取50 μL 7号管中的校准品溶液至6号管中混匀，即为1∶4稀释校准液，随后依次从6～2号管中取50 μL校准品溶液至下一校准品梯度管，依次梯度稀释得到5～1号管校准液；0号管中的缓冲液作为0浓度校准液.

细胞因子检测：离心管中加入50 μL捕获微球悬液(加入前充分混匀)、50 μL 样本或校准液，充分混匀，避光室温孵育1 h；磁性分离捕获微球并弃去上清液，加入100 μL荧光标记抗体工作液，充分混匀，室温避光孵育1 h；磁分离去上清，用200 μL磁珠稀释液洗涤微球；再次磁分离去上清，用200 μL磁珠稀释液重悬微球；最后应用流式细胞仪检测各组血浆TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和IFN-γ水平.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 CD16+单核细胞及相关亚型检测结果

采用流式细胞术检测AS组(50例)、健康对照组(40例)患者外周血中3种亚型单核细胞的百分率.以SS INT为横坐标、FS INT为纵坐标建立坐标图，结果见图1，图中C门内的细胞为单核细胞；以CD16-FITC为横坐标、CD14-PE为纵坐标建立坐标图，结果见图2.结果显示：AS组CD16+单核细胞(CD14brightCD16+，CD14dimCD16+)百分率显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；经典型单核细胞(CD14brightCD16-)百分率低于对照组，差异无统计学意义(P>0.05)，结果见图3.图1和图2中的粗点是用低概率方法处理后而显示的散点图，便于观察.

图1单核细胞群(C门)分析单核细胞亚型 Fig.1A monocyte population (phylum C) was selected for analysisN门.经典型单核细胞;O门.中间型单核细胞;P门.非经典型单核细胞.图2流式细胞术检测单核细胞亚型Fig.2Monocyte subtypes detected by flow cytometry

*.P<0.05，***.P<0.001.

2.2 检测AS组和正常对照组血浆细胞因子水平

利用多参数流式细胞仪对两组外周血细胞因子进行检测，结果显示：AS组外周血5种细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17A和IFN-γ)水平均高于对照组(P<0.05)，且AS组TNF-α、IL-6、IFN-γ水平显著高于对照组(P<0.01)，结果见图4.IL-2、IL-4在两组间无统计学差异，故结果未进行展示.

*.P<0.05，***.P<0.001.图4AS组与对照组细胞因子Fig.4Cytokines in AS group and control group

2.3 AS组CD16+单核细胞百分率与3种细胞因子水平的相关性

Pearson相关检验结果显示：AS患者外周血CD16+单核细胞(CD14brightCD16+和CD14dimCD16+)百分率与血浆细胞因子TNF-α、IL-6和IL-17A 的表达水平呈正相关关系，相关系数(r)分别为0.415 1、0.601 1和0.163 1 (P<0.01)，结果见图5.

图5细胞因子含量与CD16+单核细胞百分率的线性关系Fig.5Linear relationship between cytokine content and percentage of CD16+ monocytes

3 讨 论

单核细胞作为一种重要的免疫细胞，在AS等自身免疫性疾病的发病过程中发挥着重要作用.单核细胞具有明显的异质性，根据其表面标记CD14和CD16表达量不同可分为经典型单核细胞(CD14brightCD16-)、中间型单核细胞(CD14brightCD16+)和非经典型单核细胞(CD14dimCD16+)[1，13-14]，不同亚型单核细胞在表型、功能及炎症激活作用上均有显著的差异.有研究[15]表明：成熟巨噬细胞表达高水平的CD16，而表达低水平CD14，这个现象可使其与CD14bright单核细胞加以区分，进一步表明CD16+单核细胞比CD14bright单核细胞更成熟.

本研究应用流式细胞术检测AS患者外周血单核细胞亚型的百分率，重点研究CD16+单核细胞的变化情况.结果发现：与健康对照组比较，AS患者CD16+单核细胞(CD14brightCD16+和CD14dimCD16+)的百分率明显升高.经典的单核细胞池向CD16+单核细胞倾斜，分化的刺激因子主要是M-CSF[16-17]，进一步表明CD16+单核细胞在自身免疫性疾病中具有重要作用.

有研究[18]表明：CD16+单核细胞在多种自身免疫和感染性疾病的进展中发挥着重要作用，如风湿性关节炎、糖尿病、肺结核等.KAWANAKA N等[19]报道单核细胞亚群CD16表达升高是自身免疫性疾病和活跃性疾病状态的特征.MELGERT BN等[20]研究表明：子痫前期患者外周血中经典型单核细胞比例下降，CD16+单核细胞比例上升.对其他一些炎症性疾病的研究[21]也证实了CD16+单核细胞在各种自身免疫性疾病过程中发挥重要作用，包括类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、川崎病、感染性休克、多发性硬化、Ⅰ型糖尿病等.因此，我们推测CD16+单核细胞百分率升高可能是自身免疫性疾病和感染性疾病的共同现象.

为探究AS患者CD16+单核细胞百分率上调的具体作用机制，本研究应用流式荧光技术同步对两组血浆样本中细胞因子含量进行了检测.本研究结果显示：与健康对照组比较，AS组患者血浆炎症细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17A和IFN -γ)的含量升高(P<0.05)，其中，以TNF-α、IL-6和IL-17A上调更为明显(P<0.01).对所得结果进行Pearson相关性检验分析，结果显示：AS患者外周血CD16+单核细胞百分率与血浆细胞因子TNF-α、IL-6和IL-17A 的表达水平呈正相关关系，相关系数(R)分别为0.415 1、0.601 1和0.163 1 (P<0.01).提示AS患者CD16+单核细胞百分率的上调可促进相关炎症细胞因子的释放，进一步加重了AS患者的炎症反应.

综上所述，本研究表明：CD16+单核细胞百分率在AS患者中显著上调，且与AS患者异常的部分细胞因子的表达呈正相关关系，表明CD16+单核细胞可能通过调节细胞因子的表达参与疾病的发生和发展，此结果为AS提供了一个免疫学发病机制的新观点，未来针对AS患者CD16+单核细胞的检测可能成为其疾病诊断的新指标.然而，本研究尚未阐明CD16+单核细胞调控相关细胞因子表达的具体机制，未来将通过动物模型和体外实验进一步阐明其具体机制，为其在临床疾病监测中的应用提供更加科学的依据.