胆盐在肝移植术后缺血性胆道病变中的作用及研究进展

刘汉林 代鑫 肖奕君 吴畏

近几十年来随着器官移植技术不断发展，肝移植已成为治疗终末期肝病的有效手段。但是肝移植术后胆道并发症一直是影响肝移植受者长期生存和生活质量的最主要原因之一，其发生率为25%～38%，在活体肝移植的受者中可高达64%，病死率可高达19%[1]。而在肝移植术后胆道并发症中，缺血性胆道病变（ischemic-type biliary lesion，ITBL）是最难处理的胆道并发症之一。ITBL是指肝移植术后供肝的胆道树出现非吻合口性的狭窄和扩张，肝内胆道树受损，最终导致胆道机械性梗阻和继发性感染[2]，其又称为“非吻合口胆道狭窄”“移植物胆道病”“缺血性胆道损伤”“缺血相关胆道病变”“缺血性胆道炎”等[1,3]。进行性胆汁淤积和血管性胆道炎是ITBL两个主要的表现特征。目前临床研究及动物实验均表明，疏水性胆盐可加重肝移植术后ITBL，而亲水性胆盐则具有细胞保护作用[4]。本文将对新近研究文献做一综述，力图从胆盐细胞毒性的角度分析其致病原因，从而为未来ITBL的诊断和治疗研究理清思路。

1 胆盐与缺血性胆道病变

1.1 胆盐/磷脂比例失衡可加重ITBL

胆盐可与磷脂形成微胶粒降低其细胞毒性，此外磷脂本身对胆盐诱导的细胞凋亡也有抑制作用。因此，维持适当的胆盐/磷脂比例对于保护胆道上皮细胞至关重要。Geuken等[5]发现，人原位肝移植术后早期胆盐/磷脂比例增高，并且与胆道损伤呈正相关。Yska等[6]在对猪无心跳供肝移植的研究中发现，供肝热缺血时间延长引起术后胆盐/磷脂比例增高可以导致胆道损伤。Chen等[7]报道，冷保存时间延长可导致肝移植术后胆汁中疏水性胆盐比例增加，并有可能引起胆道损伤。李萌等[8]研究发现，Mdr2等位基因缺失的小鼠完全不能分泌卵磷脂，引起肝移植术后胆汁中的胆盐/磷脂比例失衡，从而导致胆道损伤。此外，Wang等[9]发现敲除Mdr2基因（编码磷脂转运蛋白）的小鼠无法分泌磷脂，出现疏水性胆盐的增加，导致小鼠出现严重的胆管树损伤。以上研究提示，胆汁中胆盐/磷脂比例升高，导致胆汁中游离性疏水性胆盐增加，可增加胆汁中胆盐的毒性作用，从而引起ITBL的发生。因此，对胆磷脂分泌进行主动调控可能是治疗和预防肝移植术后ITBL的一个新的途径。

1.2 亲水性/疏水性胆盐比例失衡在ITBL中的作用

胆盐作为胆汁的主要成分之一，包括疏水性胆盐和亲水性胆盐。亲水性胆盐主要包括熊去氧胆酸、猪脱氧胆酸、α-鼠胆酸和β-鼠胆酸等。疏水性胆盐主要包括胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸等。研究证实，胆盐的细胞毒性与其疏水性程度有关[4]，并且疏水性越强，其细胞毒性就越大。

近年来的研究也开始关注移植肝缺血-再灌注过程中胆汁及其成分对胆道系统的影响[10]。有研究证实，在供肝切取灌注前从静脉缓慢注入亲水性的熊去氧胆酸和去氢胆酸对胆管上皮细胞具有保护作用。此外研究还发现，供者术前静脉注射亲水性胆盐牛磺酸脱氧胆酸盐可以改善术后移植肝功能，增加胆汁流量[11]。由此可知，亲水性胆盐的预处理可以增强细胞膜的稳定性，进而增加移植肝对冷保存或再灌注损伤的耐受能力，减轻肝移植术后的缺血-再灌注损伤。在Falasca等[12]的研究中也证实，在人肝获取和冷藏过程中使用牛磺鹅脱氧胆酸对移植肝的缺血-再灌注损伤有显著的保护作用。研究发现，供肝冷缺血-再灌注损伤可引起胆汁中亲水性胆盐比例降低，疏水性胆盐比例相对升高，而亲水性/疏水性胆盐比例的失衡与ITBL的严重程度相关。因此，亲水性/疏水性胆盐平衡可能是机体的一种保护机制，一旦这种平衡被打破则有可能对肝脏和胆道造成潜在的危害，主动调控亲水性/疏水性胆盐的比例，可能是减轻ITBL的策略之一。

1.3 胆盐转运蛋白的作用

肝细胞摄取血浆内胆盐、各种有机物质、电解质和水排入毛细胆管腔，形成胆汁，其中胆盐、磷脂和胆固醇的跨膜转运需要依赖于肝细胞膜上的肝胆膜转运蛋白。Hoekstra[13]等研究发现，完全阻断大鼠肝脏的动脉血供，可以导致大鼠肝细胞膜的Na+依赖性的牛磺酸-钠共转运蛋白、胆盐输出泵和Mdr2的表达水平均下降。由此可知，移植肝缺血-再灌注或者冷保存损伤将会影响肝细胞膜和胆管细胞膜上胆盐转运蛋白的表达或活性改变，从而导致胆汁各种成分（胆盐、磷脂、胆汁酸）分泌的不平衡，引起胆汁成分变化。此外，Cheng等[14]研究发现冷保存和再灌注损伤会导致胆管上皮细胞膜上顶侧Na+依赖性胆汁酸转运体与基底侧有机溶质转运蛋白差异性表达，胆管细胞内胆盐积聚，加重ITBL。由此可见，胆盐转运蛋白的正常表达对于维持胆盐的成分及细胞内、外胆盐转运的平衡至关重要，其活性或表达的改变所导致的胆汁成分变化及细胞内胆盐蓄积可能是造成肝移植术后ITBL的重要机制之一。因此，有效调节肝细胞及胆管细胞胆盐转运蛋白表达可能是防治ITBL的有效措施。

2 碳酸氢盐与缺血性胆道病变

2.1 碳酸氢盐分泌缺陷介导胆管细胞损伤

目前认为，胆管细胞分泌碳酸氢根离子（HCO3－）在其细胞表面形成“碳酸氢盐伞”可能是抵抗胆盐毒性的主要机制之一（图1）。疏水性胆盐可诱导多种细胞类型的细胞毒性，包括处于低微摩尔浓度疏水性胆盐中的肝细胞[15]。与此形成鲜明对比的是，人胆管上皮细胞暴露于高毫摩尔浓度的疏水性胆盐中，但在生理条件下却能免受疏水性胆盐的毒性损伤[16]。一方面，胆汁中分泌的HCO3－可能与胆管细胞所分泌的黏蛋白在胆管上皮细胞表面形成了一种黏液/HCO3－保护伞，保护胆管细胞免受胆汁中毒性物质的损伤；另一方面，HCO3－的分泌可有效阻止胆汁中甘氨酸结合胆盐的质子化，而非质子化的胆盐不能通过弥散作用进入细胞，从而导致胆管细胞疏水性胆盐的毒性损伤。研究发现，人胆汁中HCO3－和H2O分泌量占总胆汁流量的25%～40%，远远超过啮齿类动物[17]。因此，由遗传、内源性或外源性因素引起的这种碳酸氢盐伞的受损或者缺陷可能导致各种类型慢性胆管病，而若能主动调节HCO3－的分泌，维持胆汁中HCO3－的正常生理浓度，可能对减轻ITBL具有重要意义。

图1 胆管细胞分泌胆汁碳酸氢盐的主要机制Figure 1 The main mechanism of bile bicarbonate secretion by bile duct cells

在人和大鼠胆管细胞中，阴离子交换蛋白（anion exchanger，AE）2与顶膜Cl－通道结合，被认为是HCO3－分泌的主要介质[18]。AE2是胆管上皮细胞中表达的主要AE蛋白，特别是在中小胆管的管腔膜上[19]。AE2是一种Na+非依赖性的Cl－/HCO3－阴离子交换器，它通过质膜交换Cl－和HCO3－，并调节细胞内的pH值。此外，AE2调节胆汁HCO3－的分泌，并在顶端胆管细胞管腔上形成胆汁碳酸氢盐伞，保护胆管上皮细胞免受疏水性胆盐细胞毒性的损害[17]。在另一项研究中同样发现，在pH值=7.4时，永生化胆管细胞AE2基因敲除后，0.75 mm鹅脱氧胆酸盐和2 m m糖醛酸去氧胆酸盐诱导的凋亡细胞分别增加3倍和2倍[20]。当胆盐暴露过程中pH值升高至8.0时，可将AE2基因敲除细胞从胆盐毒性中解救出来。由此推测，当AE2活性降低时胆管上皮细胞HCO3－分泌减少，一方面导致细胞外碳酸氢盐伞保护屏障的破坏，促进胆盐质子化而不受控制地弥散入胆管上皮细胞；另一方面，HCO3－分泌缺陷导致其在胆管细胞内积聚引起细胞内pH值升高，致使有毒的非极性疏水性胆盐在胆管上皮细胞内积聚，加重胆管细胞的损伤。

2.2 碳酸氢盐激活可溶性腺苷酸环化酶导致胆管细胞损伤

研究发现，AE2下调不仅使H69胆管细胞对胆盐诱导的细胞凋亡（bile salt induced apoptosis，BSIA）敏感，而且使H69胆管细胞对依托泊苷诱导的细胞凋亡也有敏感性[21]。此研究提示AE2下调可能对胆管细胞凋亡产生广泛影响，并表明可能存在其他影响胆管细胞凋亡的细胞内机制。因此推测，除AE2的下调允许更多的胆盐进入细胞内使胆管细胞对凋亡刺激敏感外，细胞内碳酸氢盐滞留（即由碳酸氢盐反应因子介导）也会使胆管细胞对凋亡刺激敏感。

在各种细胞内酸碱感受器中，可溶性腺苷酸环化酶（soluble adenylyl cyclase，sAC）似乎是最有可能的候选因子，因为它可以被细胞内的碳酸氢盐直接刺激。sAC首次在成年大鼠睾丸的胞浆部分被检测到[22]。最初认为sAC只在睾丸表达，后来发现其也表达于其他组织，包括肝脏、胆管细胞以及活化的CD4+和CD8+T细胞[23-25]。sAC是一种进化上保守的碳酸氢盐感受器，能够感知碳酸氢盐的增加，并提高细胞对凋亡刺激的敏感性。首先，来自AE2缺陷[（a，b）（-/-）]小鼠的成纤维细胞具有碱化的细胞内pH值（由于碳酸氢盐分泌减少），细胞内环磷酸腺苷水平较高，sAC在信使RNA和蛋白质水平上都有较高的表达。其次，AE2（a，b）（-/-）小鼠由于生精小管和附睾细胞凋亡增加而不育，这是sAC表达最丰富的地方[26]。基于以上研究结果，推测sAC的激活可能加速BSIA。同样，Chang等[24]的研究也证实，抑制sAC不仅能逆转AE2耗竭的H69胆管细胞易损性的增加，而且还能完全抑制BSIA。因此，有理由认为在AE2表达降低的ITBL患者中，除胆盐外，其他凋亡诱导因素（如细胞内碳酸氢盐的滞留）也可能导致胆管细胞凋亡的增加。此外，sAC在其他模型中也被证实介导细胞凋亡，包括冠状动脉内皮细胞的刺激性缺血或酸中毒以及心肌细胞的刺激性缺血-再灌注损伤[27-28]。

因此，在AE2下调的背景下，我们提出以下关于碳酸氢盐可能参与肝移植术后ITBL发病机制的假说（图2）。一方面，碳酸氢盐分泌受损（由于AE2表达减少）削弱了保护性的“碳酸氢盐伞”，促进胆盐质子化，导致质子化的疏水性胆盐通过直接弥散作用穿过质膜进入胆管细胞，发挥其毒性效应；另一方面，蓄积在细胞内的碳酸氢盐可诱导sAC表达并激活sAC，从而促进BSIA。

图2 在AE2下调情况下sAC参与胆管细胞损伤的机制假说Figure 2 Mechanistic hypothesis of the involvement of sAC in cholangiocyte injury in the context of AE2 downregulation

3 小 结

综上所述，肝移植术后ITBL严重影响了肝移植受者术后的长期生存和生活质量，也是导致手术失败和再次移植的重要原因。本文首次综述了胆盐细胞毒性以及碳酸氢盐伞在肝移植术后ITBL发生、发展中的作用机制，深入分析了AE2表达及相关信号通路在肝移植术后ITBL发病机制中的可能作用，展现了胆汁成分调节及HCO3－分泌调节在肝移植术后ITBL预防及治疗中的潜在价值和重要性。在临床上，除了改进外科手术技术外，应继续探索肝移植术后胆汁成分变化及HCO3－分泌缺陷的生物学机制，为寻找肝移植术后ITBL敏感预测指标及干预靶点提供可靠的实验证据，为制定肝移植术后ITBL防治策略开辟新的途径。