LED光质对走马胎生长和生理及活性成分含量的影响

李 坤，毛 纯，刘 军，吴芳兰，杨 梅*

(1 广西大学 林学院，南宁 530004； 2 广西国有七坡林场，南宁 530225)

光是植物进行光合作用的直接能量来源，是调节生命活动的基础，不同波长的光通过与相关受体发生作用而引起植物的生理生化变化，对植物的生长[1]、代谢[2]、光形态建成[3]等方面产生巨大影响。由于温室效应、洪水以及雾霾等极端天气的影响，室内补光试验及其推广应用逐渐成为研究热点，LED 作为高性价比且安全环保的半导体材料，具有光源可控、寿命长、节能等优点，为解决这一难题提供重要保障[4]。次生代谢物是植物在长期演化过程中与环境相互作用的结果，适合的处理条件能够诱导植物次生代谢过程，提高活性成分含量，通过改变光质环境来调控植物次生代谢物的合成逐渐成为一种有效且安全的手段[5-6]，如蓝光促进灵芝[7]菌丝体内总三萜的积累，提高滇重楼[8]的总皂苷含量，绿光则起抑制作用；红光显著降低黄芪[9]中黄酮和甲苷含量及单株产量；在竹叶兰[10]中，红光∶蓝光(R∶B)为1∶3处理的花色苷、总酚和类黄酮含量均为最高。由此可见，不同植物对光质的响应不同，其次生代谢物的合成途径和机制也有所变化，研究这种响应及其变化规律可为生产实践提供科学依据。

走马胎(Ardisiagigantifolia)，又叫走马风、马胎等，主要分布于中国广西、广东、贵州和四川等地，属于紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛属植物，其味苦、偏辛，具有祛风除湿、化瘀消肿的作用，可用于治疗跌打损伤、风湿病和小儿麻痹等疾病，两广民间甚至流传着“两脚迈不开，不离走马胎”的俗语，其主要活性物质皂苷更是具有抗癌功效[11]。走马胎是林下经济栽培模式的药用植物之一，其偏阴，多生于潮湿低温的地方，研究发现光照强度是走马胎生长发育的主要控制因子之一，20.2%的透光度(光照强度为82.26 μmol·m-2·s-1)能显著提高走马胎的生物量和光合作用[12]，而30%～40%的透光度更有利于走马胎茎叶皂苷的积累[13]。近年来，走马胎的药用价值倍受关注，遭到过度开采，从桂北的猫儿山到桂西南的靖西、那坡等地，天然生长的走马胎种群数量急剧下降[14]，野生资源遭到毁灭性破坏，几乎濒临枯竭，对走马胎的保护及人工培育技术研究迫在眉睫。目前，科研工作者对走马胎的研究主要集中在抗癌机理[15-16]、离体培养与快繁技术[17]等方面，本研究利用不同光质及其配比模拟实验，探索不同光质对走马胎苗木品质及皂苷产量的影响规律，为提升走马胎的人工繁殖技术以及提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验地位于广西大学林学院试验基地苗圃大棚内(22°48′N，108°22′E)，属亚热带季风气候，光照充足，降水丰沛，年均气温20.9～21.9 ℃，年均降雨量1 013～1 505 mm，且降雨多集中在5～9 月。

1.2 试验材料

试验材料为1年生走马胎幼苗(苗高8.38±0.57 cm，地径4.14±0.15 mm)，育苗杯规格为9 cm(下底直径)×14.5 cm(上底直径)×13 cm(高)，育苗基质为黄心土∶泥炭土∶椰糠=5∶3∶2，基质pH为6.27，有机质含量27.12 g/kg，全氮、全磷、全钾含量分别为2.02 g/kg、0.73 g/kg、8.84 g/kg。走马胎幼苗来源于广西玉林市南药康园苗圃基地(22°66′N，110°24′E)，生长一致，无病虫害。

1.3 试验设计

本试验采用完全随机区组试验设计，每个处理3次重复，每重复10株走马胎幼苗；试验共设置8种光质处理(表1)，分别为红光(R)、蓝光(B)、R∶B=2∶1(R2B1)、R∶B=4∶1(R4B1)、R∶B=6∶1(R6B1)、R∶B=8∶1(R8B1)、紫光(P)和绿光(G)，并以自然光为对照(CK)。每个试验小区在距离地面0.9 m高处装设2盏LED植物生长灯(型号：T52835，生产单位：深圳伟信力光电有限公司)，灯的尺寸为1 200 mm×24 mm，灯珠按照不同颜色配比均匀交叉排布。试验时间从2019年4月至2019年12月。试验管理措施：光周期12 h，处理时间段为8:00～20:00；水分每日自动喷灌2次，分别为9:00和18:00；每月每株幼苗施用等量氮∶磷∶钾=15∶15∶15的复合肥。在试验过程中，试验材料及装置均用黑色遮阴网遮盖，防止外界自然光以及各光质之间的干扰。试验所用LED灯的具体参数如表1所示，光照强度使用Apogee Instruments公司(美国)生产的MQ-500手持式光量子测量仪测定。2019年12月结束试验，测定植株的生长和生理指标。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长指标苗高为植株地上部基部到顶芽的距离，使用卷尺测量；地径为植株地上部基部直径，使用游标卡尺测量；用电子天平称量植物整株鲜重后，将鲜样放入80 ℃恒温烘箱烘干至恒重后称量干重。

1.4.2 叶绿素荧光参数每个重复选取3株长势一致、生长健壮的走马胎幼苗，于上午9:00～11:00选择幼苗第二轮叶片，使用德国Walz公司PAM 2 000系列叶绿素荧光仪测定其叶绿素荧光参数。在测定叶绿素荧光参数时，先将植物暗处理30 min，用弱光(0.05 μmol·m-2·s-1)测定初始荧光Fo，随后用6 000 μmol·m-2·s-1的脉冲光测定最大荧光Fm，并计算其PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)值；随后开启光化光，待荧光值稳定3～5 min后，即可测定其实际光化学效率Y(Ⅱ)、光化学淬灭系数qP和非光化学淬灭系数NPQ。

表1 光质处理及参数

1.4.3 生理指标取1.4.2中相同幼苗顶芽下第二轮叶片测定叶绿素含量及抗逆生理生化指标，叶绿素含量采用丙酮-乙醇混合液提取法测定[18]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法测定[18]，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定[18]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光还原法测定[19]，游离脯氨酸含量采用茚三酮显色法测定[18]。

1.4.4 皂苷含量及单株产量(1)精准称取齐墩果酸2 mg，加甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶，摇匀，得浓度为200.0 μg/mL的齐墩果酸对照品溶液。(2)精准吸取齐墩果酸对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.45和0.5 mL，置10 mL具塞试管中，70 ℃水浴挥干溶剂；依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，混匀，密塞；于60 ℃水浴加热15 min，取出，冰水浴2 min，加入冰醋酸5 mL，混匀，静置1 h，测定其在540 nm时的吸光度，绘制标准曲线。(3)精准称取走马胎整株混合样品1 g，加70%乙醇按料液比1∶20于室温下超声提取1 h，用70%乙醇补足减失的重量，过滤，滤液转移至50 mL容量瓶，70%乙醇定容、摇匀；精密吸取溶液0.2 mL，按(2)中步骤进行测定，对照标准曲线计算皂苷含量。(4)单株皂苷产量(mg/plant)=皂苷含量(mg/g)×单株干重(g/plant)。

1.5 数据处理

数据整理用Excel 2010软件，T检验、单因素方差分析(One-Way ANOVA)和多重比较(Duncan)(α=0.05)SPSS 24.0软件，用主成分分析方法对各处理进行综合排名，用Origin 2021b软件完成制图。

2 结果与分析

2.1 不同光质对走马胎幼苗生长的影响

走马胎幼苗苗高、地径、鲜重、干重及高径比在不同光质处理间均存在显著差异(表2)。走马胎苗高在R、R2B1和R4B1处理下显著高于CK，在R8B1和P处理下显著低于CK，在其余处理下与CK无显著差异；苗高以R处理最大(23.38 cm)，显著高于除R2B1处理以外的其他处理，较CK显著增长了18.5%。地径在R2B1、R4B1和R6B1处理下显著高于CK，在R、P、G处理下均显著低于CK，其余处理下与CK无显著差异；其中R2B1处理最大，且与其余处理均差异显著，较CK显著提高了11.9%。走马胎鲜重仅在R2B1处理下显著高于CK，并达到最大值，且与除R和R4B1以外的处理差异显著，较CK显著提高了8.8%；在R8B1、P、G处理下均显著低于CK，其余处理下与CK无显著差异。走马胎干重在B、R2B1、R4B1和R6B1处理下均显著高于CK，在其余处理下均与CK无显著差异，其中以R2B1处理最大，且与其余处理均差异显著，较CK显著提高了14.4%。走马胎高径比仅在R处理下显著高于CK，增幅达到24.8%，在其余处理下均与CK无显著差异。可见，紫光和绿光不利于走马胎的生长及生物量的积累，红蓝复合光更有利于走马胎各器官均衡生长，其中又以R2B1处理较佳。

2.2 不同光质对走马胎幼苗叶片光合色素含量的影响

如表3所示，走马胎幼苗叶片叶绿素a含量在P、G处理下显著低于CK，在其余处理下与CK均无显著差异，并以R2B1处理最高，是CK的1.1倍；叶绿素b含量仅在B处理下显著高于CK，增幅达到29.1%，在R、P、G处理下均显著低于CK，在其余处理下与CK无显著差异；叶绿素a+b含量在B和R2B1处理下显著高于CK，增幅分别达到13.9%和9.1%，在R4B1处理下与CK相近，在其余处理下显著低于CK；叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b含量均在G处理下最低，分别是CK的75.2%、67.4%和73.1%。类胡萝卜素含量在R和R2B1处理下显著高于CK，增幅分别达到27.0%和13.5%，在B、R4B1、R6B1处理下均显著低于CK，在其余处理下与CK无显著差异。叶绿素a/b值在各处理下均与对照无显著差异。可见，蓝光能显著提高走马胎幼苗叶片叶绿素含量，特别是叶绿素b含量，且有随着红蓝复合光中蓝光比例的降低而降低的趋势，而绿光和紫光均能显著降低叶绿素含量。

表2 不同光质下走马胎幼苗生长状况

表3 不同光质下走马胎幼苗叶片光合色素含量的变化

2.3 不同光质对走马胎幼苗叶片抗逆生理指标的影响

走马胎幼苗叶片MDA含量在R2B1和R4B1处理下显著低于CK，并以R4B1最低(1.63 μmol/g)，而在G、P单色光处理下显著大于CK，在其他处理下与CK均无显著差异(图1，Ⅰ)，说明紫色和绿色单色光处理显著提高了走马胎叶片的MDA含量，其生长受到了严重过氧化伤害。走马胎幼苗叶片的游离脯氨酸含量以G处理最高(140.35 μg/g)，是CK的1.22倍，且与其他处理均差异显著；而在R2B1和R6B1处理下显著低于CK，并以R6B1处理最低(87.73 μg/g)，仅为CK的76.5%；其余处理与对照均无显著差异(图1，Ⅱ)。走马胎幼苗叶片SOD活性变化范围是104.28～185.39 U/g，在B、R2B1、R4B1和R6B1处理下显著高于CK，在R、P、G处理下显著低于对照，并且以B处理最高，是CK的1.21倍，G处理最低，最高与最低处理相差81.11 U/g(图1，Ⅲ)；走马胎幼苗叶片POD活性变化范围为370.74～562.44 U/g，在B、R2B1处理下显著高于对照，在R、R4B1、P、G处理下显著低于对照，并以R2B1处理最高，较CK显著提高了19.6%，且显著高于其他处理，而G处理最低，最高与最低处理相差191.70 U/g(图1，Ⅳ)；G处理幼苗叶片的SOD和POD活性均显著低于CK及红蓝复合光处理。

2.4 不同光质对走马胎幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响

如表4所示，走马胎幼苗叶片最大光化学效率(Fv/Fm)在单色光R、P、G处理下均显著低于对照，降幅在6.7%～8.8%之间，在其余处理下均与对照无显著差异，并以R2B1处理最高，G处理最低；叶片实际光化学效率Y(Ⅱ)在R2B1和R4B1处理下显著高于对照，增幅分别为 13.3%和12.7%，在R、R8B1、P、G处理下均显著低于对照，降幅在12.7%～26.9%之间，并以P处理最低；叶片非光化学淬灭系数(NPQ)在R8B1和G处理下显著高于对照，增幅分别为12.9%和10.1%，而在R2B1和R4B1处理下显著低于对照，降幅分别为 7.7%和10.2%，在其余处理下与对照无显著差异；叶片光化学淬灭系数(qP)在B、R2B1和R4B1处理下显著高于对照，增幅在13.4%～16.2%之间，在R、R8B1、P、G处理下均显著低于对照，降幅在19.5%～35.3%之间，并以B处理最大，G处理最低。在单色光处理下，除NPQ外，P处理和G处理之间各参数差异不显著，但均显著低于CK和B处理；在红蓝复合光处理下，随着蓝光比例的降低，Fv/Fm、Y(Ⅱ)和qP表现出逐渐降低的趋势，而NPQ则有逐渐上升趋势。

2.5 不同光质对走马胎皂苷含量及产量的影响

走马胎皂苷含量在B、R2B1和R4B1处理下显著高于对照，在R、R8B1、G处理后显著低于对照，其余处理与对照无显著差异；B和R2B1处理皂苷含量(分别为34.53 和34.19 mg/g)显著高于其他处理，而两者间无显著差异；而R和R8B1处理的含量仅为B处理的57.0%～59.8%，为R2B1处理的57.5%～60.4%(图2，Ⅰ)。走马胎单株皂苷产量(图2，Ⅱ)在不同光质处理下存在显著差异，与皂苷含量的表现相似，单株皂苷产量在B、R2B1和R4B1处理下显著高于对照，在R6B1处理下与对照相近，在其余处理下显著低于对照；R2B1处理的单株皂苷产量最高(276.68 mg)，较CK显著增长了48.9%，蓝光B处理次之，较CK显著增长了41.4%。可见，走马胎皂苷含量和单株产量在单色红光、紫光、绿光处理下明显降低；蓝光有利于皂苷的积累，在红蓝复合光处理下，随着蓝光比例的减少而呈逐渐降低的趋势。

2.6 不同光质对走马胎幼苗影响的主成分分析

对不同光质处理下各指标进行主成分分析，基于特征值大于 1，共提取了3个主成分，结果(表5)显示，其方差贡献率分别为61.554%、14.218%和6.568%，累计贡献率达82.340%，表明这3个成分可解释不同光质处理下走马胎生长及生理指标82.340%的变异度。其中，第一主成分包括qP、Y(Ⅱ)、叶绿素含量、Fv/Fm、皂苷含量以及单株皂苷产量等，主要反映走马胎光合生理功能；第二主成分包括苗高和高径比等，主要反映走马胎营养生长情况；第三主成分主要包括MDA和游离脯氨酸，主要反映走马胎抗氧化系统强弱。同时，由表6可知，不同光质处理对走马胎生长、生理及叶绿素荧光的影响综合得分排名以R2B1处理最高(1.33)，B(0.74)和R4B1(0.64)处理次之，CK居中(0.11)，而以G处理(-1.03)最低。

表4 不同光质下走马胎叶片叶绿素荧光参数

表5 不同处理下各项指标的主成分分析

表6 不同光质处理的主成分综合得分

3 讨 论

3.1 走马胎生长指标对不同光质的响应特征

光质是影响植物生长发育的重要因子，植物通过光受体感受和传递光环境的信号变化，并调控相关基因在细胞和分子水平上的表达，从而影响生长和代谢的各个环节[20-21]。目前，已知的光受体主要包括光敏色素、隐花色素、向光色素和UV-B受体[22]，其中光敏色素主要感受红光和远红光并参与调控幼苗生长、光合系统的建立、避荫作用以及逆境生理反应等过程[23-24]；隐花色素和向光色素主要感受蓝紫光并调控茎秆生长、叶绿体发育以及激素的合成和运输等方面[25-26]。在本研究中，红光处理下走马胎幼苗的苗高最高，但地径和生物量积累较低，可能是红光导致走马胎徒长，高径比显著增大，不利于水分和物质运输；在红蓝复合光处理下，随着蓝光比例的增大，走马胎幼苗地径、鲜重和干重均呈现逐渐升高的趋势，且显著大于单色红光和蓝光。由此可见，红光比例过高对走马胎的生长产生抑制作用，而在红光中补充适量蓝光则具有显著的促进效果，在观光木中也存在生长随蓝光比例增大而加快的现象，这可能与蓝光受体蛋白调控作用有关[27]，也与植物本身特性和起源等因素密不可分[28]。

3.2 走马胎叶绿素含量和荧光参数对不同光质的响应特征

光合色素能够吸收、传递和转换光能，是植物进行光合作用的物质基础，光受体可以感应不同光质产生的光信号，并通过下游的光信号调节因子HY5调控叶绿素和类胡萝卜素的合成，从而影响植物的光合作用过程[29-30]。蓝光是植物调节叶绿素合成的关键所在，在叶绿素的生物合成过程中，其关键酶谷氨酸-1-半醛转氨酶的编码基因仅由蓝光调节，而红光会减少叶绿素生物合成的前体物质[31-32]。类胡萝卜素是光合作用中光传导途径和光反应中心的重要结构成分，也是植物体内的非酶类抗氧化剂，参与植物非光化学淬灭过程，保护其在高温、强光下免受破坏[33-34]。本研究发现，走马胎叶片中叶绿素及类胡萝卜素含量在蓝光及含蓝光比例较高的R2B1处理下显著提高，而在红光、紫光和绿光处理下含量较低，可见，蓝光有利于保护走马胎光合器官的功能稳定性，而其余单色光却不利于光保护机制的形成。同样，叶绿素荧光参数也可用于研究环境变化对光系统结构的影响，过量的光吸收对植物叶绿体存在潜在伤害，降低光合速率，发生光抑制现象，主要表现为光合结构的破坏和热耗散的增加，从而导致荧光产额与电子传递活性的大幅度下降，并在此过程中生成如活性氧等中间产物，对植物细胞膜系统造成严重伤害[35]。在本研究中，蓝光显著提高走马胎幼苗的Fv/Fm、Y(Ⅱ)和qP值，表明蓝光有利于提高走马胎幼苗PSⅡ反应中心的电子传递效率，减少热消耗，提高光能利用率；在红蓝复合光处理中，随着红光比例的增大，叶片Fv/Fm和Y(Ⅱ)值逐渐减小，NPQ值逐渐增加，表明增加红光比例导致光能利用率逐渐降低，光能多以热能的形式耗散，但相比之下，绿光、红光和紫光的光抑制和膜系统破坏程度更严重。

3.3 走马胎抗逆生理指标对不同光质的响应特征

在植物光合作用、呼吸作用、电子传递等生命活动过程中，常伴随着活性氧(ROS)的生成与清除。当植物遭受环境胁迫时，ROS大量产生，MDA含量上升，细胞膜透性增大，加速植物衰老甚至死亡[36]。但是，植物在长期进化过程中，同样演变出一套有效的ROS清除体系，该体系中的酶促系统主要以SOD作为第一道防线，将ROS快速歧化为H2O2，再通过POD等酶的作用分解成水，从而有效保护细胞和机体[37]。此外，游离脯氨酸作为植物体内重要的渗透调节物质，可以调节细胞液的浓度来维持渗透压和细胞膜结构的稳定性，同样可以防止ROS对膜脂和蛋白质的过氧化作用[38]。本研究中，在紫光和绿光诱导下，走马胎幼苗叶片MDA含量显著上升，加重叶片膜脂过氧化程度，而SOD、POD活性的显著降低更加快活性氧的积累，导致叶绿素降解，降低光合作用、呼吸作用和其他代谢过程，这解释了为什么在紫光和绿光处理下走马胎生长指标均较差。相反，在蓝光比例较大的红蓝复合光处理下，激活了植物体内的酶促抗氧化系统，走马胎幼苗叶片SOD和POD活性显著上升，MDA含量显著降低，膜质和蛋白质受到的伤害减小。值得注意的是，在光化学反应过程中，会产生活性氧族分子，若无法及时平衡植物体内活性氧含量，会严重影响电子传递速率以及光能利用率[39]，这也可能是本研究中R2B1处理下电子传递速率显著上升的原因。

3.4 走马胎皂苷含量及其产量对不同光质处理的响应特征

皂苷是走马胎重要的次生代谢物，不仅参与植物的通讯、防御和感觉调控[40]，而且对癌细胞具有较强的抑制作用[41]。适宜光质处理不仅提高幼苗营养生长能力，还促进其次生代谢物的积累[28, 42]。本研究中，走马胎皂苷含量以蓝光处理最高，R2B1处理次之，两者均显著高于对照，但R和R8B1处理则显著降低；走马胎单株皂苷产量以R2B1处理最高，蓝光次之，分别较CK显著提高了48.9%和41.4%，而红光和R8B1处理的产量均较低，这表明蓝光对走马胎皂苷合成具有显著促进作用，而红光存在不同程度的抑制作用。已有研究发现，皂苷含量与植物活性氧自由基的清除具有显著的相关性，七叶一枝花皂苷含量与其CAT活性呈显著正相关，而与SOD活性、POD活性和MDA含量间存在极显著的负相关[43]；三七总皂苷可抑制ROS和MDA的产生，并显著提高SOD、CAT活性[44]。本研究中R2B1处理显著提高走马胎皂苷含量，其SOD和POD活性同样最高，在一定程度上抑制了ROS和MDA的生成，更有利于走马胎健康稳定的发育。

综上所述，不同 LED 光质对走马胎幼苗的生长和有效成分的积累产生显著影响。单色红光和过高的红光比例会对走马胎生长造成一定的胁迫作用，导致MDA含量增加，抗氧化酶活性降低，不利于走马胎的生长发育；在红光基础上增加适当比例蓝光更有利于走马胎光合色素的合成、抗氧化系统的协调以及叶绿素荧光参数的稳定，从而促进走马胎健康稳定的生长，提高活性成分含量。综合所有形态指标和生理指标测定结果，R2B1、B和R4B13个处理均显著优于CK，其中R2B1处理最有利于走马胎生长及活性成分积累，有效改善植株生长状况，提高走马胎苗木品质和药材产量。