D5S818基因座等位基因丢失对亲子鉴定结果的影响

兰菲菲 陈延冰 何天文 梁杰

广东省妇幼保健院医学遗传中心（广州 511442）

短串联重复序列（short tandem repeat，STR）是人类基因组DNA 中的一类具有长度多态性的DNA 序列，片段长度一般在500 bp 以内，符合孟德尔遗传定律，被广泛应用于亲权鉴定检测中。受不同人群基因多态性及引物结合位点突变等因素的影响，亲权鉴定检测实践中会遇到STR 位点发生的一些特殊现象，例如突变、off-ladder、等位基因丢失、稀有等位基因等等［1］。STR 基因座的基因分型特点，有研究人员采用不同的检测体系，在不同人群中进行了分析［2-5］。基因多态性也是较为常见的引起STR 基因座发生特殊基因分型的原因之一，不仅对STR 扩增结果有一定影响，同时也与一些疾病的发病相关［6-7］。由于STR 基因座的等位基因丢失对于亲子鉴定结果有不同程度的影响，及时发现并运用正确的分析检测方法是十分必要的。

D5S818 基因座位于人类5 号染色体5q23.2 区域，是由AGAT 组成的四核苷酸核心重复序列，等位基因分型范围在7～18 波动。D5S818 基因座是1997年美国联邦调查局建立的联合DNA 索引系统（Combined DNA Index System，CODIS）的13 个STR 基因座之一［8］，是司法部司法鉴定科学研究院能力验证亲权鉴定项目考核内容的19 个常染色体必检STR 基因座。在亲子鉴定的实际检测应用中，笔者发现利用PowerPlex21 系统检测STR 基因座分型时会出现个别基因座的等位基因丢失现象。该现象对亲子鉴定结果分析有一定的影响，从而干扰亲子关系的鉴定结论，本文详细报道了D5S818 基因座等位基因丢失现象的分析及避免其对鉴定结论影响的方法。对PowerPlex21 系统D5S818 基因座的等位基因丢失情况进行了总结与验证，提出该系统在中国南方汉族人群中D5S818基因座检测位点的局限性。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究所用样本为本院司法鉴定所2017-2019年受理的换发出生医学证明、入户等司法用途亲子鉴定案例的积累。与委托人签署知情同意书后，采集受检者外周静脉血2 mL 或者毛囊等生物检材用于实验检测及分析。用于亲权鉴定商业化的一些检测系统中包含有D5S818 基因座（表1），本研究的样本检测采用PowerPlex21 系统。在对3 248 例家系亲子鉴定的结果分析中发现，5 个家庭的7 名个体在D5S818 基因座出现了等位基因12 的丢失。

表1 包含D5S818 基因座的8 种STR 分型商业化检测系统Tab.1 Eight commercial STR genotyping systems with D5S818 locus

1.2 主要试剂与仪器 试剂：PowerPlex21 复合扩增体系（美国Promega 公司），AmpFLSTR Identifiler复合扩增体系（美国AB 公司）。仪器：2720 型PCR扩增仪（美国AB 公司），3500XL 基因分析仪（美国AB 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 STR基因座的等位基因分型 用Chelex-100（浓度为5%）法，样本经过洗涤、离心收集沉淀细胞、Chelex-100 孵育后煮沸，提取DNA 待用。DNA样本按照PowerPlex21 复合扩增体系的说明书，复合扩增21 个STR 基因座。PCR 扩增的反应体系为10 μL：Buffer Mix 2 μL，Primer Set 2 μL，ddH2O 6 μL，DNA 1 μL。PCR 扩增条件：96 ℃1 min；94 ℃10 s，59 ℃1 min，72 ℃30 s，30 个循环；60 ℃10 min。扩增产物用3500XL 基因分析仪电泳，用GeneMapper ID-X Vertion1.3（美国AB 公司）自动分析STR 基因座的基因型。

1.3.2 D5S818 基因座等位基因丢失的验证 发生等位基因丢失的7 名个体及其家系，用Chelex-100法重新提取样本的DNA，根据Identifiler 复合扩增体系的说明书，复合扩增16个STR基因座。PCR扩增的反应体系为25 μL：PCR Reaction Mix 10.5 μL，Primer Set 5.5 μL，DNA Polymerase 0.5 μL，DNA 10 μL。PCR 扩增条件：95 ℃11 min；94 ℃1 min，59 ℃1 min，72 ℃1 min，28 个循环；60 ℃60 min。扩增后的产物电泳与分析与1.3.1 内容相同，选择Identifiler 体系的分析方法和内标。

1.3.3 累积亲权指数（CPI）计算 根据GeneMapper ID-X Vertion1.3 分析的STR 基因座等位基因分型，使用鉴定所自主研发的亲权指数计算软件、按照司法部颁布的《亲权鉴定技术规范》［9］中的计算方法，分别计算每个STR 基因座的父权指数（PI）和每个家庭的累积亲权指数。PowerPlex21 与Identifiler 体系分别进行计算，根据CPI 的计算结果得出鉴定结论。

2 结果

2.1 D5S818 基因座可能存在等位基因丢失 在3 248 案例中使用PowerPlex21 体系检测分析时发现，有5 个家系的分析结果中D5S818 基因座提示母亲发生“突变”，电泳图显示为“纯合”而峰高与杂合等位基因的峰高相似，分析D5S818 基因座可能存在等位基因丢失的情况，5 个家系D5S818 基因座的电泳图谱见图1。

图1 D5S818 基因座等位基因分型图谱（PowerPlex21 体系）Fig.1 Genotyping map of D5S818 loci（PowerPlex21 system）

2.2 Identifiler 体系验证D5S818 基因座等位基因12 的丢失 可能发生等位基因丢失的5 个家系样本重新提取DNA，采用Identifiler 体系进行PCR复合扩增后发现，其中7 名个体能够检测分析出D5S818 基因座的等位基因12（图2），说明这7 名个体在使用PowerPlex21 体系扩增时发生了等位基因12 的丢失（表2）。

表2 D5S818 基因座的分型及等位基因丢失情况分析Tab.2 Genotyping of D5S818 locus and analysis of allelic loss

图2 D5S818 基因座等位基因分型图谱（Identifiler 体系）Fig.2 Genotyping map of D5S818 loci（Identifiler system）

2.3 D5S818基因座等位基因丢失对CPI的影响使用PowerPlex21 体系检测分析出现的等位基因丢失家系，属于单个基因座的不符合遗传规律情况，易被误认为“突变”进行CPI 的计算。本文中的5 家系根据PowerPlex21 和Identifiler 的STR 基因座等位基因分型结果计算CPI，由于PowerPlex21体系出现“突变”，分别计算父子与母子的二联体CPI 以确认是否存在父子或者母子关系，见表3。

表3 D5S818 基因座等位基因丢失家系的CPI 计算Tab.3 CPI calculation of D5S818 allele loss families

3 讨论

亲权鉴定检测中存在STR 基因座的等位基因丢失现象［10］，其发生的原因有几种可能性，例如不同人群STR 基因座的多态性或者个体DNA 在STR基因座的核心序列内发生了突变［4，11］，以及在检测体系的引物扩增结合区发生了突变的情况［12-14］，都会使等位基因扩增失败而发生假丢失。使用不同的商业化检测体系均有报道STR 基因座等位基因丢失的情形，例如用Goldeneye 20A 与PowerPlex Fusion 体系检测在D2S1338 基因座发现丢失等位基因19［15］、Microreader21 ID 体系中发生了D18S51基因座的等位基因19 丢失［13］、D18S51 基因座使用GoldenEye 20A 体系检测出现了等位基因18，19 的丢失［16］、PowerPlex21检测体系中D8S1179基因座丢失等位基因13［17］。Penta E 基因座在Microreader21 ID 与Goldeneye 20A 体系均出现过丢失等位基因11［18］。随着检测人群数量的增加，STR 基因座多态性的影响效应也逐渐呈现得较为明显［19-22］，而不同的检测体系在同一基因座的分型范围及等位基因的频率分布差异也并不相同。因此，明确不同体系检测方法STR 基因座等位基因丢失情况及其对鉴定结果影响，在亲子鉴定实践中具有重要参考价值。

本文发现在中国南方汉族人群中利用该体系检测时，D5S818 基因座的等位基因12 容易发生丢失。根据研究报道显示，使用华夏白金检测系统调查D5S818 基因座的等位基因分型范围为7-15［23］，PowerPlex21 系统中D5S818 基因座的等位基因分型范围为6-18，AmpFLSTR Identifiler 系统分型范 围 为7-16，PowerPlex21 系统中D5S818 等 位基因的检测分型范围略广泛，在该基因座出现offladder 等位基因几率稍小一些。有研究人员利用PowerPlex21 检测系统对国内福建、湖南、山西、黑龙江等小样本群体进行了遗传调查并分析遗传关系［24］。张柠等［25］采用PowerPlex21 检测系统对云南苗族人群常染色体STR 基因座遗传多态性调查中发现，D5S818 基因座的等位基因频率分布差异较大。因此，对于较特殊的等位基因分型现象，例如等位基因丢失或off-ladder 等，由于检测引物与扩增范围及效率的不同，利用不同检测体系对D5S818 基因座特殊等位基因分型的检测效率也会有差异。由于PowerPlex21 研发的人群数据来源于西方人群，在中国人群的检测使用中可能会出现由于多态性不同或者该基因座引物结合区DNA 位点属于突变敏感区域，导致出现等位基因缺失的情况。因此，考虑研制较适合中国人群的D5S818 基因座扩增引物区域，完善体系检测从而避免D5S818 基因座等位基因12 丢失的发生。

发生在孩子的等位基因丢失现象在实际检测分析过程中容易被忽略，如果恰好被检父与生母在该基因座中有相同的等位基因分型，孩子则能够在父母中找到已经检测到的未“丢失”的等位基因来源，则丢失等位基因的基因座由于符合遗传规律而往往不容易被发现。另外一种情况，等位基因丢失容易被误认为成“突变”，在鉴定实践过程中被发现的等位基因丢失绝大多数属于该种情形，本文中发现的5 个家系属于此种情况，由于发生等位基因丢失的基因座“不符合遗传规律”而被发现。当这种假突变是“多步突变”时，按照“突变”计算该基因座的PI 值，在“突变”步数较多的情况下计算得出的CPI 可能与实际的鉴定结论不符合。本文中其他4 个家系均容易误认为在D5S818基因座发生了母源性突变而导致母子关系的误判。但是本研究存在不足之处，由于5 个家系恰好都是母亲或孩子发生的等位基因丢失，所以父子关系的判断并没有受到影响，未能研究分析父亲发生等位基因丢失的情况。在今后的研究中应逐步积累增加分析的样本量，进一步探讨父亲发生等位基因丢失对鉴定结果的影响。

因此，出现D5S818 基因座等位基因“不符合遗传规律”的情况应查看电泳图谱峰高辨别杂合与纯合情况，同时分析孩子在该基因座的等位基因遗传来源，注意分辨这种“突变”是否由于发生了等位基因12 的丢失所致，有条件时可以选择有相同基因座检测位点的商业化体系进行验证。本文的研究经过多年检测案例的经验积累，对PowerPlex21 体系检测出的D5S818 基因座“突变”一般采用Identifiler 体系检测是否发生了等位基因12 丢失，并采用Identifiler 体系的检测结果作为鉴定分析结果与鉴定结论的依据，从而规避可能影响鉴定结论的风险因素。