广州市鼠类动物钩端螺旋体的感染调查

杨利超 ,郭銮英 ,王妮娜 ,马 骏 ,李国慧 ,陈守义 ,刘 全

钩端螺旋体病(Leptospirosis)是一种由螺旋体目(Spirochaetales)螺旋体科(Leptospiraceae)钩端螺旋体属(Leptospira)的致病性钩端螺旋体引起的人兽共患疾病。钩端螺旋体种类较多,目前已发现有23种,共有10种对人和动物致病[1]。我国发现有问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、博氏钩端螺旋体(L.borgpetersenii)、圣地罗西钩端螺旋体(L.santarosai)和韦氏钩端螺旋体(L.weilii)4种[11],其中广东主要流行问号钩端螺旋体(L.interrogans)。钩端螺旋体可感染多种宿主,主要有鼠类动物(黑线姬鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、褐家鼠等)和家畜(猪、犬和牛等)[2],其中鼠类与人生存环境接近,人接触被鼠类污染的水和土壤后通过受损皮肤或者粘膜而感染钩端螺旋体,临床主要表现为发热、头痛、发冷等症状,更严重者会出现肝损伤和黄疸、肾功能衰竭和内出血等严重后果,进而导致死亡[3]。

钩端螺旋体病主要在热带和亚热带国家流行[4],属于全球公共卫生领域关注的重要人兽共患传染病[5]。根据我国传染病防治法,钩端螺旋体病属于乙类传染病。早在1934年,中国广东省就报告了首例人钩端螺旋体病[6],到目前我国有29个省份曾报道该病流行,在1955年至2016年间我国共出现了10次钩端螺旋体病发病率超过10/10万的特大流行[7],共造成超过254万人感染该病,其中有2万多人死亡[8]。

广州市地处亚热带沿海地区,温热多雨,鼠类动物种类繁多,与人类接触密切,这增加了钩端螺旋体病等鼠类动物疾病在该地区传播的风险[9],因此,有必要了解宿主动物的流行情况。近年来,尚无文献详细报道使用PCR 技术对广州市鼠类动物感染钩端螺旋体流行情况的监测。因此,本研究调查了广州市鼠类动物中致病性钩端螺旋体病的流行情况和遗传特征,为广州市钩端螺旋体病的预防与控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集 本实验室2018－2019年在广州市花都区、海珠区和从化区采用笼捕法捕捉鼠类动物共200只。所有动物均在24 h内送回实验室并在生物安全柜内解剖,采集脾脏,置入无菌无酶EP管中,置于－80 ℃冰箱保存待用。

1.2 总DNA 的提取 无菌无酶EP管中取样本约5 g,加入400μL 4 ℃预冷的DMEM 培养液,使用组织研磨仪(Qiagen),72 Hz研磨3 min后,12 000 r/min 4 ℃离心10 min,取上清液250μL,使用DNA 提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司),提取组织中的DNA。实验操作过程根据试剂盒说明书的流程进行,最终获得DNA 共50μL 置于－80 ℃待用。

1.3 巢式PCR 扩增和测序 参考文献报道的钩端螺旋体16SrRNA和LipL32基因引物[10],对提取的总DNA 用巢式PCR 进行细菌序列扩增。反应第1轮扩增体系10μL:Ex Taq 0.15μL(TaKaRa公司),10×Ex Taq Buffer 1μL,d NTP Mixture 0.8 μL,上下游引物各0.4μL(10μmol/L),模板1μL,补充双蒸馏水至10μL。第2 轮扩增体系50μL:Ex Taq 0.25μL(Ta KaRa公司),10×Ex Taq Buffer 5μL,d NTP Mixture 4μL,上下游引物各2μL(10μmol/L),模板1μL,补充双蒸馏水至50μL。反应条件:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,退火(温度见表1)30 s,72℃延伸(时间见表1),35个循环;72 ℃延伸5 min。PCR 产物经DUT-48蓝光切胶仪检测,阴性对照模板使用无核苷酸酶双蒸水代替,选择条带大约在1 230 bp和730 bp的特异性条带,送到广州天一辉远公司测序。具体引物信息和扩增条件见表1。

表1 PCR 引物和扩增条件Tab.1 PCR primers and amplification conditions

1.4 序列分析与比对构建系统进化树 将获得的测序结果,在NCBI-BLAST 上进行序列比对鉴定,确定获得核酸序列属于目的序列。使用软件Mega7.0对获得的序列进行比对和处理,采用邻接法(Neighbor joining method,NJ)基于Kimura-2-Parameter(K2P)模型,Bootstrap test 1 000 次,构建系统发育树。

2 结果

2.1 样品采集情况 在广州市3个区采集到5种鼠类动物共200只。其中花都区褐家鼠100只;从化区褐家鼠20只、臭鼩鼱22只、板齿鼠4只、黄胸鼠3只、黄毛鼠1只;海珠区褐家鼠50只(图1)。

图1 广州市样品采集地点Fig.1 Map of Guangzhou showing locations of sample collection

2.2 PCR 检测结果 在200份样品中共检出3份钩端螺旋体阳性样本,编号分别为HDSP52、64、72,16SrRNA基因和LipL32 基因检测率一致,总阳性率为1.5%。花都区褐家鼠中检出阳性3 份(3.0%),从化区和海珠区均为阴性(表2)。PCR 产物经过1.5%琼脂糖电泳见明显1 230 bp和730 bp的目标条带,与预期大小一致(图2)。

图2 褐家鼠中钩端螺旋体巢式PCR 结果Fig.2 Nested PCR results for Leptospira in Rattus norvegicus

表2 样品采集与检测情况Tab.2 Sample collection and testing

2.3 系统进化树分析 经Meg Align软件同源性分析,本研究扩增获得3 条16SrRNA和LipL32基因阳性样本序列之间的同源性分别为99.3%～99.6%和97.7%～99.2%。将测序获得符合质量的序列,在NCBI-BLAST 进行同源性比对,与Gen-Bank中获得的10 种致病性钩端螺旋体的16S rRNA基因和9种致病性钩端螺旋体的LipL32基因序列进行比对,比对结果截齐后构建系统进化树。图3所示,阳性样本HDSP52、64、72与致病性问号钩端螺旋体(L.interrogans)菌株在同一个分支内,与L.interrogans(MT645311.1、LC459958.1)亲 缘关系最近,序列同源性大于99%。图4所示,阳性样本HDSP52、64、72 与致病性问号钩端螺旋(L.interrogans)菌株在同一个分支内,与L.interrogans(EU871718.1、AY461906.1)亲缘关系最近,序列同源性为99%。

图3 基于10种致病性钩端螺旋体16S rRNA 部分序列构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA partial sequences of ten pathogenic Leptospira

图4 基于9种致病性钩端螺旋体Lip L 32部分序列构建的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on Lip L 32 partial sequences of ten pathogenic Leptospira

3 讨论

近年来我国在钩端螺旋体病的预防、控制方面取得了较大的进步,钩端螺旋体病在人群中发病率和死亡率逐年下降。然而,由于致病性钩端螺旋体可感染多种动物宿主[11],其流行后会在疫区野生动物中长期存在,我国每年都有人因钩端螺旋体病而死亡,因此钩端螺旋体病仍是我国重要的人兽共患传染病。

鼠类动物是多种病原体的宿主,同时也是与人类接触最多的动物之一[12]。随着经济、旅游和商业开发等的发展,使鼠类动物原有的生态环境遭到改变,造成鼠类动物迁徙、流窜[13]。当宿主动物感染钩端螺旋体后,受感染的动物可通过尿液排菌,从而污染土壤,而频繁的降雨会将钩端螺旋体污染的土壤冲入水体,增加人通过接触被钩端螺旋体污染的水或土壤而感染钩端螺旋体的概率[14]。广州市是一个人口密集,降雨频繁且水网密布的地区,也是钩端螺旋体病多发的地区。对广州地区鼠类动物中钩端螺旋体病的情况进行监测,对了解当地钩端螺旋体在宿主中的流行情况,并有针对性地做好预防与控制,防止钩端螺旋体病在广州传播有重要作用。

近年来随着分子生物学技术的发展,特别是聚合酶链反应(PCR)方法,具有高敏感性、检测准确性、成本低和效果好等特点,因此广泛用于钩端螺旋体的监测。2015年胡群等[15]通过PCR 技术对宁波梅山口岸72只鼠类肾组织进行钩端螺旋体检测,发现在黑线姬鼠中阳性率为6.9%;张翠彩等[16]通过暗视野显微凝集试验(检测抗体)和MLST 技术对2016－2018年捕捉的江西省1 404只鼠类动物进行钩端螺旋体检测,在黑线姬鼠和黄毛鼠中检测到,阳性率为4.6%。而在本研究中,褐家鼠中钩端螺旋体阳性率是1.5%,这由于钩端螺旋体的宿主特异性和地域的不同,在Dhewantara等[17]的研究调查中显示,宁波、江西省属于高发地区,广东属于发病中等地区,这与本研究的实验结果基本一致;2005年许晓茵等[18]对广州市番禺区鼠类动物进行钩端螺旋体血清凝集溶解试验(检测抗体),鼠类阳性率为32.5%;2011年孙小康等[19]在广东省清远市对鼠类动物进行钩端螺旋体暗视野显微凝集试验(检测抗体),在板齿鼠、黄毛鼠、臭鼩鼱、褐家鼠和黄胸鼠检测到,阳性率为22.3%。本研究结果比广州市番禺区、清远市报道的感染率低,这可能与本研究的检测方法、检测组织有关,且与黑线姬鼠是钩端螺旋体的优势鼠种有关,而本研究中的鼠类主要是褐家鼠。与之前的研究相比,本研究使用PCR 技术进行检测,可较为直接的反映广州市鼠类动物中钩端螺旋体的流行情况。

脾脏作为机体重要的淋巴器官,在机体免疫钩端螺旋体的过程中发挥着重要作用。钩端螺旋体感染宿主动物,经过潜伏期后,在血液中大量繁殖,进而迅速扩散到机体的组织器官[20],但在不同组织器官的选择适应性有很大差异。在肾脏中钩端螺旋体受机体免疫系统的影响较小,故尿中可长时间排菌[21]。遗憾的是,本次研究的样本只获得了脾脏,不能分析在同一只鼠类动物不同器官钩端螺旋体分布的差异。

本研究是首次在广州地区使用PCR 技术对鼠类动物进行钩端螺旋体流行情况检测,在花都区褐家鼠中鉴定出3株致病性问号钩端螺旋体(L.interrogans)。在鼠类动物中进行钩端螺旋体病流行情况的监测有重要的公共卫生学意义,本研究为广州市钩端螺旋体病的预防与控制提供参考依据。

利益冲突:无

引用本文格式:杨利超,郭銮英,王妮娜,等.广州市鼠类动物钩端螺旋体的感染调查[J].中国人兽共患病学报,2022,38(6):473-477.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.055