一株解淀粉类芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

鲁 萍，于龙政

1.延边大学附属医院肿瘤内科，吉林延吉 133002；2. 延边大学农学院，吉林延吉 133002；3.东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心，吉林延吉 133002

随着抗生素的广泛应用，出现药物残留、机体耐药性的产生等诸多问题。因此，目前积极开展替代抗生素的微生态制剂的研究。微生态制剂是从自然界中分离得到的有益微生物，通过微生物工程工艺制作成含有活菌或其代谢物的活菌剂。微生态制剂可以平衡宿主肠道内的微生物菌群，调节免疫力，其代谢物可以抑制病原菌，具有安全、无药物残留、有利于动物的生长繁殖等优点，被广泛重视和应用。解淀粉类芽孢杆菌是广泛存在于自然界中的杆菌，解淀粉类芽孢杆菌的分离鉴定报道较多，但多数是从植物中分离。反刍动物的瘤胃中栖息着多种微生物群，本试验旨在从羊瘤胃内分离菌源，对其进行菌种鉴定、生长情况、耐酸、耐胆盐、抑菌作用等研究，以期为微生态制剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

教学牧场的羊瘤胃内容物，RCM培养基、药敏纸片购自青岛海博生物技术有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生物有限公司，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌为实验室从腹泻病例分离菌株。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化

从教学牧场的羊瘤胃瘘管处采集羊瘤胃内容物物，用无菌PBS稀释后80 ℃水浴加热10 min。热处理后的内容物涂布在RCM固体培养基中，37 ℃培养24 h。挑取菌落，反复纯化分离3次，得到纯培养物。对纯培养物进行革兰氏染色镜检。

1.2.2 分子生物学鉴定

对分离纯化的菌进行16S rRNA鉴定分析。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，进行PCR扩增。引物为细菌16S rRNA基因通用引物，上游引物 27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACG CT-3'，下游引物1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGA CTTCACCCC-3'。PCR扩增采用20 µL反应体系，其中:2×Taq Mix 10 µL，10 nM引物各1 µL，菌液DNA 2 µL，ddH2O 6 µL。PCR扩增的反应条件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行35个循环；最后在72 ℃延伸10 min。将PCR产物送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。利用NCBI数据库中的BLAST工具对序列进行比对，应用软件Clustalx和MEGA建立系统发育树。

1.2.3 生长曲线测定

挑取分离纯化的单个菌落接种到液体培养基中培养，制成菌悬液。菌液按照2%的接种量接种到新的RCM液体培养基中，并每隔2 h取样品，测定其菌液的OD值，38 h后绘制出该菌的生长曲线。

1.2.4 耐酸和耐胆盐能力测定

耐酸试验：pH为7.0的PBS用0.1 mol/L的盐酸分别调节pH至4.0、3.0、2.0，高压灭菌。取菌悬液0.1 mL，分别加入到装有9.9 mL上述pH的PBS试管中（3次平行试验），制成菌悬液，并在37 ℃摇床培养3 h。做3个稀释度，各取100 µL培养液涂在普通琼脂培养基平板上，37 ℃培养24 h，平板菌落计数。以原菌液作为对照，计算菌株的存活率。

耐胆盐试验：分别称取猪胆盐，加入PBS溶解，使其浓度分别为0.1%、0.2%和0.3%，高压灭菌后备用。取菌悬液0.1 mL，加入到装有9.9 mL上述浓度的猪胆盐溶液的试管中（3次平行试验），充分混匀，在37℃摇床培养3 h。做3个稀释度，取100 µL培养液涂布在普通琼脂培养基平板上，37 ℃培养24 h，平板菌落计数。以原菌液作为对照，计算菌株的存活率。

1.2.5 抑菌试验

将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，测试分离菌的抑菌特性。将分离菌株在平皿上点种，培养过夜，按照每7 mL的0.7%软琼脂接种300 µL指示菌为比例，接种指示菌，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径。

2 结果

2.1 菌落及细菌形态

羊瘤胃中分离纯化的菌株Y1在RCM培养上菌落呈现圆形、边缘不整、淡黄色、不透明、大菌落。革兰氏染色后菌株Y1呈紫色、短杆状，为革兰氏阳性菌。

2.2 系统发育树分析

提取菌液DNA，经27 F和1 492 R引物PCR扩增，得到1.5 kb左右的PCR产物。PCR产物纯化后测序。将菌株Y1的16S rRNA序列在GenBank数据库进行比对，应用Lasergene软件进行同源性分析，菌株Y1与解淀粉类芽孢杆菌（GenBank No.MK618627, KC355293）同源性最高，为99.7%。应用软件Clustalx构建遗传进化树，应用MEGA软件绘制遗传进化树（图1）。经分析发现，菌株Y1与解淀粉类芽孢杆菌遗传距离最近，处于同一进化分支上；与解淀粉芽孢杆菌（GenBank No.KY357304）和枯草芽孢杆菌（GenBank No.X60646）不在同一分支上。

图1 菌株Y1的系统进化树

2.3 生长曲线

菌液经过培养，每隔2 h取样品，测定其菌液的OD值，绘制生长曲线。由Y1生长曲线可知，经过4 h生长迟缓期，进入对数生长期。在14 h进入稳定生长期，34 h后进入衰落期。

2.4 耐酸、耐胆盐特性

经过不同pH的PBS处理，在37 ℃培养3 h之后，在pH 2.0、3.0、4.0的存活率分别为0、0.15%、51.23%。该菌在pH 3.0条件下可存活，但存活率低。在pH 4.0条件下存活率可达50%以上。

经过不同浓度的猪胆盐在37 ℃培养3 h之后，在0.1%（w/v）猪胆盐条件下细菌存活率83.4%，0.2%猪胆盐条件下细菌存活率为75.3%，0.3%猪胆盐条件下细菌存活率为66.5%，随着胆盐浓度的增加，存活率下降，但仍保持在60%以上，具备耐胆盐特性。

2.5 抑菌试验

以大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，检测该菌的抑菌效果。结果没有抑菌圈出现，表明分离到的菌对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌没有抑菌作用。

3 讨论

本研究从羊瘤胃内容物中分离到一菌株，经过形态学观察和16S rRNA鉴定，该菌株与解淀粉类芽孢杆菌形态相同，革兰氏阳性菌，同源性高达99.7%、遗传距离最近，鉴定为解淀粉类芽孢杆菌。

解淀粉类芽孢杆菌培养2 h后进入对数生长期，在培养14 h后进入稳定期；在pH 4.0条件下存活率可达50%以上，在0.3%猪胆盐条件下细菌存活率为60%以上，表明该菌的生长规律适合肠道内繁殖。为进一步帮助机体消化吸收提供基础。

大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是肠道主要致病菌。本试验分离纯化的解淀粉类芽孢杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均无抑制作用。这结果与王政露等人报道的解淀粉芽孢杆菌的结果一致，然而也有报道解淀粉芽孢杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌均有抑制作用。这可能与菌株差异有关，因此在开发益生菌剂时应选择对肠道病原菌具有良好抑制作用的菌株。