一步法RT-LAMP-HNB 检测兰花建兰花叶病毒和齿舌兰环斑病毒方法的建立

徐 匆，黄 皓，罗华建，杜见南，黄晓彦，陈 彦，梁卫驱，胡 珊

（东莞市农业科学研究中心，广东 东莞 523086）

【研究意义】兰科（Orchidaceae）植物是开花植物中最大的家族之一，拥有800 多个属28 000 余种，广泛分布于各种生态环境，并表现有高度特异的形态、结构和生理特点［1-3］。据统计，全世界兰花病毒有50 余种，建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）是从兰花上分离到的分布最广、危害最严重的病毒之一，能引起兰科植物植株花叶畸形、坏死，花瓣变色，生长受抑等症状，传播途径主要有汁液、桃蚜和接触等［4-7］。CymMV 为马铃薯X 病毒属（Potexvirus），单链RAN 病毒，基因组序列约6 200 nt，含5 个开放阅读框［8］。齿舌兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）同样为兰花中最为普遍的病毒之一［4-5］，属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），单链RNA 病毒，基因组全序列约5 800 nt［9］。该病毒会导致兰花叶片产生环斑、花朵色素不均、局部坏死、大大降低植物活力等［10］。通过组织培养繁殖进行大规模栽培早已成为兰花产业的生产趋势，而通过组织培养感染病毒的传播方式成为了兰花产业的主要威胁［11-12］。然而，目前没有有效的措施能够控制病毒病，因此，建立针对病毒的高效监测、检测方法，尽早检出染病植株并实施销毁，对控制兰花病毒感染具有至关重要的意义。【前人研究进展】目前已有的研究中，针对兰花病毒检测方法包括生物学检测［13］、电镜观察法［14-15］、血清学检测［16-17］和分子生物学检测［8,18-21］4 类。生物学检测法虽然操作简单，但病毒病症状多样，操作环境严格，固有周期长，目前大多作为辅助手段；电镜检测取样简单，所需时间短，但对操作人员要求高，所用仪器昂贵；血清学检测法特异性强、需时短，但易出现假阳性、灵敏度不高等缺点；分子生物学检测法检测病毒核酸验证病毒是否存在。Raymond 等［22］用多重RT-PCR 对CymMV、ORSV、Orchid fleck virus（OFV）进行检测，结果显示其灵敏度高于电镜检测；樊荣辉等［23］则利用SYBR Green I 作为指示剂，建立RT-LAMP 方法来进行CymMV 的检测，其灵敏度为RT-PCR的10 倍。【本研究切入点】分子生物学方法的灵敏度和特异性比其他方法更高,操作简便,适应性强，有可能成为新的常规检测手段。分子生物学检测最常见的是RT-PCR 以及在此基础上发展出的一些技术如IC-RT-PCR、多重RT-PCR、荧光定量RT-PCR 等等，虽然PCR 具有诸多优点，但需要特定仪器，不利于在基层或不便利地区推广使用。【拟解决的关键问题】本研究拟采取可视化反转录-环介导等温扩增技术（RT-LAMP）结合羟基萘酚蓝（HNB）建立CymMV 和ORSV 的一步法RT-LAMP-HNB 检测方法。该方法中涉及的核酸扩增技术是一种仅用水浴锅就能够完成的检测技术，在LAMP 反应体系中加入HNB 作为产物指示剂，既能够满足肉眼判读结果的要求，又能够避免开盖检测引起气溶胶污染出现的假阳性，更适合在实际检测中应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试病毒为兰花建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）、齿舌兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）来源于东莞市农业科学研究中心兰花大棚及美国Agdia 公司。

RNA 提取试剂 盒（SteadyPure Virus DNA/RNA Extraction Kit）、一步法RT-PCR 试剂盒、核酸染料GoldView 购自艾科瑞生物工程有限公司，WarmStart ®LAMP 试剂盒（DNA＆RNA）购自基因工程有限公司。

核酸蛋白分析仪DU800 购自美国贝克曼公司，凝胶成像系统Biospectrum AC 410 购自美国UVP 公司，电泳仪DYY-12 购自北京六一生物有限公司。

1.2 引物设计

从NCBI下载CymMV、ORSVcp基因序列，利用ClustalX 比对后，选取保守序列使用PrimerExplorer V5设计LAMP 简并引物，通 过Primer Primer5.0 设计RT-PCR 简并引物，引物序列如表1 所示。

表1 RT-LAMP-HNB 及RT-PCR 引物序列Table 1 RT-LAMP and RT-PCR primer sequences

RT-LAMP-HNB 反应体系：反应混合物（Warmstart Lamp Kit，NEB，USA）12.5 µL，外引物（F3/B3）2.5 µL（终浓度 0.2 µmol/L），内引物（FIP/BIP）2.5 µL（终浓度1.6 µmol/L），HNB（FLUKA，终浓度 200 µmol/L）［24］0.25 µL，模板1 µL，补充 H2O 至终体积 25 µL。混匀后加入20 µL 石蜡油，60 ℃ 反应1 h，85 ℃ 5 min 终止反应。

以表1 所列CymMV F1/B1、ORSV F3/B3 为RTPCR 引物，使用一步法RT-PCR 试剂盒（艾瑞科生物有限公司），扩增目的片段，CymMV 目的片段大小为575 bp，ORSV 目的片段大小为190 bp。

RT-PCR 体系：酶2 µL，缓冲液 12.5 µL，引物 5 µL（终浓度 0.4 µmol/L），1 µL 模板 DNA/RNA，补充 H2O 至终体积 25 µL。扩增条件为94 ℃ 30 sec，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 30 个循环，72 ℃ 5 min。

1.3 检测项目及方法

1.3.1 RT-LAMP-HNB 特异性及灵敏性检测 用CymMV、ORSV RT-LAMP 引物分别扩增CymMV 和ORSV，验证RT-LAMP-HNB 检测方法的特异性。

将提取的CymMV RNA、ORSV RNA进行100、101、102、103、104、105、106、107梯度稀释，以此为模板进行RT-LAMP-HNB 反应，然后根据试验结果去判断该反应的灵敏性。

1.3.2 田间样品检测 针对市场购买的20 株蝴蝶兰进行CymMV、ORSV 的RT-LAMP-HNB 及RT-PCR 检测，检测方法见1.2。

1.3.3 产物检测 RT-LAMP、RT-PCR 产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析，以GoldView（艾瑞科生物有限公司）为核酸染料。

2 结果与分析

2.1 RT-LAMP-HNB 检测方法的建立

抽提已知感染了CymMV、ORSV 的兰花样品 RNA，并以此RNA 为样品模板，纯水为阴性对照，使用表1 所列RT-LAMP 引物进行核酸扩增，结果见图1，产物经过凝胶电泳（图1 上部分）后出现明显梯形条带；图1 下部分显示，RT-LAMP-HNB 扩增体系呈蓝色，阴性对照呈紫红色，说明RT-LAMP-HNB 检测方法建立成功。

图1 RT-LAMP-HNB 法检测结果Fig.1 Results of RT-LAMP-HNB detection

2.2 RT-LAMP-HNB 特异性检测

使用CymMV、ORSV LAMP 引物对已知分别含 有CymMV、ORSV 及CMV 的RNA进行RTLAMP 扩增，以检测该方法的特异性，结果见图2，凝胶电泳结果显示CymMV 引物仅能够扩增出CymMV 的RNA片段，而ORSV、CMV都未出现扩增条带；RT-LAMP-HNB 结果也显示针对ORSV、CMV 的扩增体系颜色为紫红色，CymMV扩增体系为蓝色。ORSV cp 引物仅能够扩增出ORSV 的RNA 片段，CymMV、CMV 未出现扩增条带，RT-LAMP-HNB 结果也显示仅ORSV RNA样品的检测结果为阳性。上述结果说明CymMV、ORSV 的RT-LAMP-HNB 检测方法均具特异性。

图2 RT-LAMP-HNB 特异性检测结果Fig.2 Results of RT-LAMP-HNB specificity assays

2.3 RT-LAMP-HNB 灵敏性检测

对CymMV、ORSV 的RT-LAMP-HNB进行灵敏性检测，并与RT-PCR 进行比较。提取已知感染CymMV、ORSV 的兰花样品RNA，将RNA按 照100、101、102、103、104、105、106、107梯度稀释，以稀释后的RNA 为扩增模板，RT-PCR扩增片段预计分别为575、190 bp，结果见图3。两种病毒的RT-PCR 扩增条带在RNA 模板稀释103倍时可见，至104倍不可见；RT-LAMP 扩增产物凝胶电泳结果显示在RNA 模板稀释104倍时仍有明显扩增条带；RT-LAMP-HNB 体系在100～104倍稀释时都呈蓝色，表示有扩增产物，与RT-LAMP 凝胶电泳结果保持一致，灵敏性同样比RT-PCR 高10 倍。

图3 RT-LAMP-HNB 及RT-PCR 灵敏性检测结果Fig.3 Results of RT-LAMP-HNB and RT-PCR sensitivity assays

2.4 RT-LAMP-HNB 田间检测

为了检测本研究中建立的RT-LAMP-HNB 在实际生产中的使用效果，对市场购买的20 份蝴蝶兰样品进行CymMV、ORSV 检测，同时以RTPCR 作为对照检测方法，结果见图4。RT-PCR凝胶电泳显示,在对CymMV 病毒的检测中1、2、3、4、6、10、13、14、15、16、7、18、19、20号样品有明显扩增条带，大小与目的片段一致；5、7、8、9、11、12 号样品未扩增出目的片段。RT-LAMP-HNB 体系扩增后显色结果与RT-PCR凝胶电泳结果保持一致，20 份蝴蝶兰中有14 个样品检测出CymMV 阳性，占比70%（图4A）。ORSV 病毒检测结果（图4B）显示，RT-LAMPHNB 体系扩增后显色结果同样与RT-PCR 结果保持一致，5、6、7、11、14、15、16、17、18、19、20 号样品检出ORSV 阳性，1、2、3、4、8、9、10、12、13 号样品未检出ORSV，20 份蝴蝶兰中11 个样品检出ORSV 阳性，占比55%。

图4 RT-LAMP-HNB 及RT-PCR 田间检测结果Fig.4 Field detection results of RT-LAMP-HNB and RT-PCR

根据上述结果，本研究建立的CymMV 和ORSV RT-LAMP-HNB 检测方法对田间样品的检测结果与传统的分子生物学检测方法RT-PCR 结果保持一致，显示该法能够适用于针对兰花两种病毒的田间病毒检测。

3 讨论

本研究以CymMV、ORSV 的cp基因为目的基因建立了CymMV 和ORSV 的RT-LAMP-HNB检测方法。该法具有常规LAMP 方法灵敏度高、特异性强的特点，在与RT-PCR 及RT-LAMP 进行灵敏度比较时发现，RT-LAMP-HNB 的灵敏度较RT-PCR 高10 倍，与凝胶电泳检测的RTLAMP 结果保持一致。此外，常规LAMP 检测需要通过凝胶电泳检测扩增产物，开盖后产物极易形成气溶胶污染实验环境从而造成假阳性，RTLAMP-HNB 则能够通过肉眼直接观测体系颜色变化，判断是否有扩增产物产生，避免了常规LAMP 气溶胶污染的发生。

目前对于CymMV、ORSV 分子检测技术的研究主要集中在以RT-PCR 和RT-LAMP 为基础的方法上，如梁芳［20］等根据cp基因保守区设计引物，建立了CymMV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 的检测方法，结果显示灵敏度较RT-PCR 高100 倍。但该法需要使用荧光定量PCR 仪，不适用于基层使用；谭建锡等［25］对兰花的5 种病毒CMV、ORSV、CymMV、辣椒褪绿病毒（CaCV）以及落葵皱纹花叶病毒（BaRMV）建立了可视化基因芯片检测方法，该研究设计了多重RT-PCR引物及特异性探针，利用RT-PCR 方法进行核酸扩增后与特异性探针杂交显色后分析结果，结果显示可检出的病毒阳性质粒不低于103拷贝/µL。该法可一次性检测5 种病毒核酸，但文中未对田间样品进行检测，在实际生产中的可应用性未知；樊荣辉［23］等利用SYBR Green Ⅰ与双链DNA 结合的特性，在RT-LAMP 体系中加入SYBR Green Ⅰ来判读结果，其研究显示该法能够特异性的扩增CymMV，灵敏度为RT-PCR 的10倍，与本研究结果一致，利用RT-LAMP 和RTPCR 对田间样品进行检测后发现，两种方法的检测结果保持一致，检出率为60%；Tsa 等［26］根据RNA-dependent RNA polymerase（RdRp）基因序列保守区设计引物，利用RT-LAMP 对ORSV 进行检测，结果显示RT-LAMP 较RT-PCR 灵敏度高100 倍，但该法仍需要进行凝胶电泳，极易造成后续检测的假阳性。

由 于CymMV 和ORSV均为RNA病毒，而RNA 易降解，在抽提过中极易产生损失，且RNA抽提过程也较为繁琐，后期研究过程中可设法提高检测方法的灵敏度，回避RNA 抽提，进一步提升该检测方法的灵敏度；此外本文采用的田间样品为蝴蝶兰，后期可将田间样品扩大到卡特兰、石斛兰、国兰等其他品种的兰花，扩大RTLAMP-HNB 在兰花生产中病毒检测监控上的应用性。

4 结论

LAMP 技术自2000 年被发明以来，因其恒温扩增核酸的特点，在植物病原检测领域被广泛应用［27-28］。但是由于LAMP 产物极易形成气溶胶从而造成结果假阳性，诸多学者将研究焦点集中在不开盖检测LAMP 产物的方法上［29］，以提高LAMP 在实际应用上的价值。本研究针对CymMV和ORSV 各自的cp基因序列设计LAMP 引物，在反应体系中加入HNB，如发生环介导等温扩增，体系颜色由紫红色变为蓝色，从而能够判读结果的阴性或阳性。为了证实本研究建立的RTLAMP-HNB 在实际生产中的可应用性，对田间20 份蝴蝶兰样品进行RT-LAMP-HNB 及RT-PCR检测，结果CymMV 和ORSV 的RT-LAMP-HNB检出率分别为70%、55%，与RT-PCR 检测结果保持一致，能够准确的进行田间样品检测，后期可用于蝴蝶兰样品中CymMV、ORSV 病毒感染的检测监控。