俄色叶HPLC 指纹图谱建立及7 种成分测定

徐俊陈华林陈蓉康晋梅李敏

（成都中医药大学，中药材标准化教育部重点实验室，省部共建西南特色中药资源国家重点实验室，四川成都611137）

俄色叶为蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malus toringoide（Rehd.）Hughes.或花叶海棠Malus transitoria（Batal.）Schneid.的干燥叶及叶芽［1］，在《四部医典》［2］、《晶珠本草》［3］、《藏药晶镜本草》［4］中均有记载，具有攻坚化积、除腻涤滞、保肝利胆的功效，它已被开发的雪域俄色茶［5-9］、功能性食品［10-11］、保肝药物［12-13］、俄色黄酮分子胶囊［14］、俄色-A 毛囊靶向脂质体［15］、俄色总黄酮缓释栓剂与片剂［16-17］、俄色黄酮微囊［18］、俄色黄酮-β-环糊精包合物［19］、复方颗粒剂［20-21］等，在药用、食用方面均具有重要价值。另外，该属植物包括多种海棠，在性状、成分方面存在相似性［22］。

目前，俄色叶质量标准仅以根皮素为含量测定指标，不能有效地控制其质量［23］。因此，建立俄色叶HPLC 指纹图谱，并同时测定绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素的含量，以期为完善该药材质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SQP 电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；Milli-Q Advantage A10 超纯水仪（德国默克密理博公司）。

1.2 试剂与药物 绿原酸（批号wkq16052705）、金丝桃苷（批号wkq16050305）、异槲皮苷（批号wkq16050607）、槲皮苷（批号wkq17113002）、根皮 苷（批 号 wkq17122002）、槲皮素（批 号wkq17072005）、根皮素（批号wkq17081715）对照品均购自四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均大于98 %。乙腈、甲醇为色谱纯；磷酸等其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3 药材 俄色叶共13 批（编号S1～S13），经成都中医药大学李敏教授鉴定为蔷薇科植物变叶海棠Malus toringoides（Rehd.）Hughes.或花叶海棠Malus transitoria（Batal.）Schneid.的干燥叶或叶芽，具体信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 HPLC 指纹图谱建立

2.1.1 色谱条件 Insertsil ODS-3 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～10 min，10%～12% A；10～15 min，12%～15% A；15～16 min，15%～18% A；16～60 min，18% A；60～65 min，18%～22% A；65～70 min，22%～25%A；70～80 min，25%～30%A；80～85 min，30%～40%A；85～92 min，40%A；92～100 min，40%～52%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长340 nm；进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取对照品绿原酸、槲皮素各1 mg，金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷各2 mg，根皮苷10 mg，根皮素5 mg，置于25 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 取药材细粉（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL75% 甲醇，称定质量，超声提取45 min，放冷，75% 甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度试验 取同一份供试品溶液（S2），在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得各成分色谱峰相对峰面积RSD 为0.12%～2.06%，相对保留时间RSD 为0.02%～0.34%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.2 重复性试验 取同一批样品（S2），按“2.1.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得各成分色谱峰相对峰面积RSD 为0.07%～2.42%，相对保留时间RSD 为0.03%～0.23%，表明方法重复性良好。

2.1.4.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液（S2），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得各成分色谱峰相对峰面积RSD 为0.28%～2.71%，相对保留时间RSD 为0.01%～0.57%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.5 图谱生成 取13 批样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，记录色谱图，将相关数据导入“色谱指纹图谱相似度评价系统”2012A版，采用共有模式图谱生成对照指纹图谱（R）［24］。同时取对照品溶液适量，对其中7 个色谱峰进行指认定性，见图1～2。由此可知，13 批样品HPLC 指纹图谱中有17 个共有峰，指认出其中7个，即5 号峰为绿原酸，8 号峰为金丝桃苷，9 号峰为异槲皮苷，11号峰为槲皮苷，12 号峰为根皮苷，13 号峰为槲皮素，14 号峰为根皮素。再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版，以共有模式图谱（R）为参照，发现其相似度良好，为0.948～0.993。

图1 13 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints for thirteen batches of samples

图2 各成分HPLC 色谱图（Ⅰ）Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents（Ⅰ）

2.2 聚类分析 以7 个共有峰的相对峰面积为原始数据，采用SPSS 25.0 软件中的组间平均数联结法进行聚类分析，结果见图3。由此可知，13 批样品可聚为3类，S1、S3、S5、S7、S8 为第1类，S10、S11、S12、S13 为第2类，S2、S4、S6、S9为第3 类。

图3 13 批样品聚类分析图Fig.3 Cluster analysis diagram for thirteen batches of samples

2.3 7 种成分含量测定

2.3.1 色谱条件 Insertsil ODS-3 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～5 min，12%～15% A；5～15 min，15%～20% A；15～28 min，20% A；28～48 min，20%～42% A；48～50 min，42%～50% A；50～55 min，50%～12% A）；体积流量0.7 mL／min；柱温30 ℃；检测波长340 nm；进样量10 μL。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，置于不同25 mL 量瓶中，75%甲醇溶解并定容，制得贮备液，分别取适量至同一10 mL 量瓶中，75%甲醇稀释，即得（绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素质量浓度分别为0.125、0.35、0.86、0.38、9.3、0.01、0.85 mg／mL）。

2.3.3 供试品溶液制备 同“2.1.3”项。

2.3.4 系统适应性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，结果见图4。由此可知，各成分分离度和理论塔板数良好，阴性无干扰。

图4 各成分HPLC 色谱图（Ⅱ）Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.5 方法学考察

2.3.5.1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液4 000、2 000、1 000、600、250 μL，置于不同10 mL量瓶中，75% 甲醇制成系列质量浓度，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，见表2。由此可知，各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.5.2 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定6次，每次10 μL，测得绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素峰面积RSD 分别为1.63%、0.12%、0.22%、0.57%、0.21%、0.94%、0.85%，表明仪器精密度良好。

2.3.5.3 重复性试验 精密称取药材粉末（S6）6份，每份0.5 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下各进样10 μL测定，测得绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素峰面积RSD 分别为0.98%、1.15%、0.96%、1.40%、0.85%、1.34%、1.86%，表明该方法重复性良好。

2.3.5.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液（S6），室温下于 0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素峰面积RSD 分别为0.63%、0.38%、0.54%、1.92%、0.51%、1.77%、0.60%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5.5 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的药材粉末（S6）6份，每份0.25 g，按100%水平加入对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素平均加样回收率分别为96.4%、99.5%、99.8%、100.1%、99.9%、99.0%、99.9%，RSD 分别为 1.3%、1.0%、0.7%、0.8%、0.4%、2.9%、0.7%。

2.3.5.6 样品含量测定 结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%， n＝3）

3 讨论

本实验考察不同流动相（甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸）、检测波长（256、286、330、340、345、350、355、360 nm），结合分离度、色谱峰数目和峰形、基线平稳程度，最终分别确定为乙腈-0.1%磷酸、340 nm。再考察不同提取方法（超声、加热回流）、提取溶剂（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、乙醇）、超声时间（30、45、60 min），最终确定为75%甲醇超声提取45 min。

聚类分析结果显示，13 批俄色叶聚为3类，与该药材来源和药用部位存在一定相关性，其中叶芽中各成分总含量高于叶中。另外，S8 与S2、S4、S9 的相似度较低，表明不同基原俄色叶在成分含量上可能存在一定差异。

俄色叶中异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、根皮素含量较高，而绿原酸、金丝桃苷、槲皮素较低。上述7 种成分均具有保肝、抗氧化、保护心血管等药理活性［25-30］，可为全面评价俄色叶质量提供参考。