基于网络药理学研究活血调脂方对糖尿病性脂肪肝糖脂代谢的作用

周涛涛徐定昌平菁张春枚孙继佳王雨秾*

（1.上海中医药大学基础医学院，上海201203； 2.上海中医药大学数学与物理教研室，上海201203）

中国的糖尿病性脂肪肝患者数量预计在未来的几十年将大规模增加［1］，严重代谢紊乱带来的健康问题将引起巨大的医疗负担［2-8］，活血调脂方是上海中医药大学附属龙华医院肝病科副主任医师王雨秾副教授的经验方，针对糖尿病性脂肪肝脾虚湿盛兼夹血瘀的特点配伍而成，在临床诊疗中发现该方具有很好的降低糖尿病性脂肪肝患者肝脂肪水平的作用。

通过筛选活血调脂方中的有效成分以及糖尿病性脂肪肝的治疗靶点，以建立药物有效成分-靶点-疾病网络并进行GO 功能和KEGG 富集分析，运用网络药理学方法揭示并体外验证活血调脂方治疗糖尿病性脂肪肝的作用机制。

1 方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 有效成分的收集与筛选 活血调脂方由丹参、西红花、荷叶、绞股蓝、土茯苓、苍术、徐长卿7 味药配伍而成，分别通过TCMSP（http：／ ／tcmspw.com／tcmsp.php）、TCMID（http：／ ／119.3.41.228：8000／tcmid／search／）对药物成分进行收集，并补充《中药大辞典》［9］收录的成分，再与PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）数据库进行核验校 对。利 用 SwissADME（http：／ ／www.swissadme.ch／index.php）在线数据分析软件，以Lipinski、ESOL Class、GI absorption、Bioavailability Score 为指标，对活血调脂方中的化学成分进行筛选，Lipinski 取0；ESOL Class 为化合物溶解性指标，在筛选时除去评价为“poorly soluble”的成分；Bioavailability Score 为口服利用度得分，取值≥0.55；“GI absorption”是评价化合物的胃肠道吸收的情况，保留评价为“high”的成分。

1.1.2 有效成分和疾病的靶点预测和识别 使用SEA（http：／ ／sea.bkslab.org／）、HitPick（http：mips.helmholtzmuenchen.de／proj／hitpick）和 SwissTargetPrediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／index.php）数据库对有效成分进行靶点预测。在DisGeNET（http：／ ／disgenent.org／home／）、DrugBank（https：／ ／go.drugbank.com／）、OMIM（https：／ ／omim.org／）和TTD（http：／ ／db.idrblab.net／ttd／）数据库分别收集2 型糖尿病和非酒精性脂肪性肝病相关的基因，使用Venny 2.1.0 在线分析系统（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／）将2 个病从4 个数据库中收集到的靶点基因取交集得到2 个病的交集基因，即得到糖尿病性脂肪肝的相关基因。

1.1.3 构建有效成分-靶点-疾病网络图 将有效成分、药物作用靶点和疾病相关基因输入Cytoscape 3.8.1 构建了活性成分-靶点-疾病网络图，可视化有效成分和相关靶点之间的作用关系，并使用Network-Analyzer 插件对网络图进行分析。

1.1.4 靶点GO 功能与KEGG 富集分析 引用R 语言数据包对疾病相关基因进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，并且根据P值和基因数目自动生成GO 功能和KEGG 富集注释图。选取P＜0.01 的3 条核心通路运用Cytoscape 3.8.1软件构建靶点-通路网络图。

1.1.5 构建PPI 网络与模块分析 将有效成分与糖尿病性脂肪肝的交集基因导入STRING（https：／ ／string-db.org／）数据库，设置Organism 参数为Homo Spaiens，将Combine Score 阈值取为0.4。使用Cytoscape 3.8.1 的CytoNCA 插件对KEGG 富集得到的3 条核心通路的关键蛋白基因进行分析，得到关键蛋白基因的Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC、Netowork 评分。

1.1.6 分子对接验证 通过分子对接技术将有效成分-靶点-疾病网络图中Degree 值大于19 的有效成分与KEGG 富集得到的3 条核心通路的关键蛋白进行分子对接验证。在Pubchem 下载有效成分的2D 结构，再使用ChemBio3D Ultra 14.0 软件对2D 结构按照最小自由能进行优化得到小分子配体文件。通过PDB 数据库（http：／ ／www1.rcsb.org／）得到核心靶点的pdb 结构文件，再使用Pymol 软件（https：／ ／pymol.org／2／）去除核心靶点pdb 结构文件中的水分子和小分子配体得到蛋白受体文件。将小分子配体文件和蛋白受体文件导入AutoDockTools 1.5.6 软件计算每对小分子配体和蛋白受体文件最佳结合的区域，通过AutoDock Vina 软件（http：／ ／vina.scripps.edu／）进行半柔性分子对接计算得到每对小分子和作用靶点的亲和力值（affinity）。使用Discovery Stuido 2019 软件绘制有效成分与靶点的结合构像图并标注出结合位点。

1.2 实验材料

1.2.1 细胞 人肝癌细胞HepG2 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.2.2 试剂与药物 丹参（批号200914）、西红花（批号202010）、绞股蓝（批号201022）、荷叶（批号20201015）、土茯苓（批号200917）、苍术（批号20201013）、徐长卿（批号200812）均购自上海中医药大学附属曙光医院。盐酸二甲双胍（批号S30880）购自上海源叶生物科技有限公司；阿昔莫司（批号32200925）购自鲁南贝特制药有限公司。GAPDH 抗体（批号AF1186）购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒（批号WB0123）购自上海威奥生物技术有限公司；细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS-3）抗体、固醇调节元件结合蛋白-1C（SREBP-1C）、HRP 标记的山羊抗兔IgG 抗体（批号ab16030、ab28481、ab205718）购自英国 Abcam公司；脂联素（Adiponectin）抗体、过氧物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、胰岛素受体底物1（IRS-1）、磷酸化胰岛素受体底物1（Phospho-IRS-1）、糖原合成激酶-3β（GSK-3β）、磷酸化糖原合成激酶-3（Phospho-GSK-3）、Akt、Phospho-Akt（批 号 2789T、2435T、3407T、2385T、12456T、5558T、4691T、4058T）购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2.3 活血调脂方制备 参照临床给药剂量，称取活血调脂方药材丹参36 g，荷叶36 g，绞股蓝84 g，苍术24 g，土茯苓84 g，徐长卿84 g，西红花2 g，用蒸馏水充分浸没煎煮2 h，汤液过滤除渣，用旋转蒸发仪（温度设置50 ℃，转速40 r／min）将滤液浓缩至膏状，将浸膏-80 ℃冷冻24 h后置于冷冻干燥机中冷冻干燥，得粉率为8.14%，收集干燥粉末样品，-20 ℃密封保存。称取1 g 活血调脂方冻干粉溶解于10 mL 去离子水中，充分震荡摇匀，配制成100 mg／mL的活血调脂方母液，3 000 r／min 离心10 min，经0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，分装后-20 ℃冰箱中保存备用，临用时用培养基稀释成不同剂量。

1.3 实验方法

1.3.1 油酸钠、棕榈酸钠、活血调脂方对HepG2 细胞存活率的影响 以每孔1×104个细胞密度接种于96 孔板中，用含不同剂量油酸钠、棕榈酸钠、活血调脂方的培养基孵育24 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL）在37 ℃继续孵育4 h，弃去孔内液体后，加入150 μL 二甲基亚砜，并通过酶联免疫检测仪检测570 nm 波长处的光密度（OD）值。基于对照组的结果，将获得的OD值进行归一化处理，并计算各组细胞存活率。

1.3.2 活血调脂方对HepG2 细胞胰岛素抵抗模型的影响 参考文献［10］报道配制棕榈酸钠溶液，对照组不作处理；模型组用含有指定剂量棕榈酸钠溶液孵育24 h；活血调脂方组在棕榈酸钠溶液孵育24 h 后给予不同剂量活血调脂方继续孵育24 h，二甲双胍组则加2.5 mmol／L 二甲双胍。对照组、模型组、活血调脂方组、二甲双胍组均取半数给予100 nmol／L 胰岛素刺激，另一半不作处理，同时在无血清的高糖培养基再孵育4 h，比较各组间细胞对胰岛素的敏感性。葡萄糖水平检测参照试剂盒说明书进行操作。

1.3.3 活血调脂方对HepG2 细胞脂肪肝模型的影响 参考文献［11］报道配制油酸钠溶液，细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素／链霉素的DMEM 高糖培养基中，于5%CO2、37 ℃下培养。对照组不作处理；模型组用指定剂量油酸钠溶液孵育24 h；活血调脂方组在油酸钠溶液处理24 h后给予不同剂量活血调脂方再继续孵育24 h，阳性组则加1 mmol／L 阿昔莫司。甘油三酯检测和油红O 染色（×100）参照试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 Western blot 检测蛋白表达 以每孔3.5×105个细胞密度接种于6 孔板，设置对照组、模型组、阳性组（二甲双胍组或阿昔莫司组）和活血调脂方低、中、高剂量组。对照组正常孵育；模型组使用指定剂量棕榈酸钠或油酸钠溶液孵育24 h；活血调脂方组在棕榈酸钠或油酸钠溶液处理24 h 后给予不同剂量活血调脂方再继续孵育24 h，阳性组则加2.5 mmol／L 二甲双胍或1 mmol／L 阿昔莫司。收集各组细胞，加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液，提取细胞总蛋白，采用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，蛋白样品经凝胶电泳，转至NC膜，脱脂牛奶封闭2 h，分别加入GAPDH（1∶1 000）、IRS-1（1∶1 000）、p-IRS-1（1∶1 000）、GSK-3β（1∶1 000）、p-GSK-3β（1∶ 1 000）、Akt（1∶ 1 000）、p-Akt（1∶1 000）、SREBP-1C（1∶ 1 000）、SOCS-3（1∶ 1 000）、Adiponectin（1∶1 000）和PPARγ（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗膜后加入HRP 标记的山羊抗兔IgG 抗体（1∶2 000），37 ℃孵育2 h，ECL 发光试剂盒显影，使用ImageJ 1.8.0_172 软件进行半定量分析。

1.4 统计学分析 通过SPSS 24.0 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学差异。

2 结果

2.1 网络药理学分析

2.1.1 活血调脂方中的有效成分 从TCMSP、TCMID、《中药大辞典》 中共获得成分347个，其中丹参53个，荷叶11个，绞股蓝36个，西红花43个，苍术93个，土茯苓61个，徐长卿50 个。利用SwissADME 对成分进行筛选后得到198 个有效成分。

2.1.2 活血调脂方治疗疾病的靶点基因 通过SEA、HitPick、SwissTargetPrediction 得到有效成分的靶点基因411个。通过DisGeNET、DrugBank、OMIM、TTD 4 个数据库得到糖尿病性脂肪肝相关基因234 个。通过取交集得到活血调脂方治疗糖尿病性脂肪肝的54 个作用靶点，并在GeneCard 数据库中对所有靶点基因再次核验。

2.1.3 构建有效成分-靶点-疾病网络图 建立有效成分-靶点-疾病网络图（图1）更加全面地揭示活血调脂方治疗糖尿病性脂肪肝的有效成分和作用靶点之间的作用关系。其中，蓝色是有效成分，红色是有效成分作用于糖尿病性脂肪肝的靶点基因。该网络显示了1 107 个节点和404 条边，具有更大的度值和更多边缘的节点发挥更加重要的作用，用Cytoscape 3.8.1 软件中的Network Analyzer 插件进行分析选取Degree 值大于19 为核心成分，具体见表1。

图1 成分-靶点-疾病网络图

表1 核心成分表

2.1.4 GO 功能分析 使用R 语言clusterProfiler 数据包得到活血调脂方作用靶点的GO 功能分析注释图（图2A），基于P＜0.05 得到1 381 个GO 条目，其中生物进程1 262个，细胞结构34个，分子功能85 个。在生物进程中，交集靶点主要富集在脂肪酸代谢过程、对异源生物刺激的反应、类固醇代谢过程等条目；在细胞结构中，交集靶点主要富集在细胞顶端部分、神经细胞体、膜筏等条目；在分子功能中，交集靶点主要富集在血红素结合、四吡咯结合、铁离子结合等条目。

2.1.5 KEGG 富集分析 使用R 语言clusterProfiler 数据包得到活血调脂方作用靶点的KEGG 富集分析注释图，基于P＜0.05 得到32 条通路，图2B 上显示P＜0.01 的15 条通路主要与癌症、免疫、氧化应激、代谢、生物降解、耐药性、信号转导、病毒性疾病等内容相关。在15 条通路中PPAR信号通路、非酒精性脂肪性肝病、胰岛素抵抗这3 条通路与疾病关系最为密切，图2C 显示了靶蛋白在预测通路上的分布，红色表示靶蛋白，蓝色为体外实验验证的重要位点，并使用Cytoscape 3.8.1 软件构建这3 条通路的靶点-通路网络图（图2D），在此基础上开展了后续的机制验证。

图2 GO 功能分析和KEGG 富集分析

2.1.6 PPI 核心网络 使用STRING 构建PPI 网络图（图3），共有节点54个，220 条边，每个节点平均有8.15 条边，局部聚类系数为0.394。使 用Cytoscape 3.8.1 的CytoNCA 插件对KEGG 富集得到的3 条核心通路的关键蛋白基因进行评分，关键蛋白基因的得分情况见表2。

表2 靶点蛋白评分表

图3 蛋白互作网络图

2.1.7 分子对接 通过分子对接研究发现活血调脂方中的核心有效成分quercetin（槲皮素）、3beta-hydroxyatractylon、kaempferol（山柰酚）、alpha-eudesmol（α-桉叶醇）、［（4S）-2-oxo-4-［（E）-1-oxobut-2-en-2-yl］-3，4-dihydropyran-5-yl］acetate、isorhamnetin（异鼠李素）、resveratrol（白藜芦醇）、myristic acid（肉豆蔻酸）与7 个关键通路蛋白GSK3B、INSR、GLUT1、LXRA、PI3K、PPARγ、FABP 的亲和力值小于-5 kcal／mol，如表3 所示，说明这些有效成分与核心靶点结合稳固［12］，能够改善或治疗糖尿病性脂肪肝。选择亲和力值小于-7 kcal／mol 的关键蛋白和活性分子绘制对接模式图，见图4。

图4 活血调脂方治疗糖尿病性脂肪肝的重要靶点与活性成分的分子对接

表3 Vina 分子对接结果表

2.2 细胞实验

2.2.1 油酸钠、棕榈酸钠、活血调脂方对HepG2 细胞存活率的影响 如图5 所示，与对照组比较，0.8（低剂量）、1.2（中剂量）、1.6 mg／mL（高剂量）活血调脂方、1 mmol／L油酸钠和150 μmol／L 棕榈酸钠的处理对细胞存活率无明显影响（P＞0.05），生存率均大于90%，表明没有显著的细胞毒性，可以用于造模和给药。

图5 细胞毒性实验

2.2.2 活血调脂方对HepG2 细胞糖脂代谢的影响 如图6～7 所示，与未添加胰岛素刺激的对照组比较，胰岛素增加了细胞的葡萄糖消耗（P＜0.05），棕榈酸钠处理的模型组对胰岛素的刺激敏感性下降，并且葡萄糖消耗量相比于对照组下降了15.6%，这表明棕榈酸钠诱导成功建立了胰岛素抵抗模型。与模型组比较，活血调脂方中、高剂量组细胞葡萄糖消耗增加（P＜0.05），并且胰岛素刺激后葡萄糖消耗也增加（P＜0.05），表明中、高剂量活血调脂方增加HepG2 细胞的葡萄糖摄入，同时改善了胰岛素敏感性；活血调脂方低剂量组葡萄糖消耗增加（P＜0.05），但胰岛素刺激后葡萄糖消耗情况无明显变化（P＞0.05）。

图6 活血调脂方对糖代谢的影响

通过GPO-PAP 酶法检测不同浓度活血调脂方对HepG2细胞脂肪肝模型中TG 水平和脂质积累的影响。如图7A 所示，模型组的TG 水平约为对照组的3.7 倍。与模型组比较，低剂量给药组的TG 水平降低约15.4%，中剂量约为24.6%，高剂量约为47.2%。此外，通过显微镜观察油红O 染色后细胞内脂质积累的差异，如图7B 所示，与对照组比较，模型组染色更深，表明模型组细胞内脂质积累增加，而中药给药组之间的着色程度随着药物剂量的增加而递减。

图7 活血调脂方对糖脂代谢的影响

2.2.3 活血调脂方对胰岛素信号通路的影响 如图8 所示，与对照组比较，棕榈酸钠诱导的模型组p-IRS-1 和p-Akt 表达降低（P＜0.05），p-GSK-3β 表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，活血调脂方组细胞p-IRS-1、p-Akt 表达升高（P＜0.05），p-GSK-3β 表达降低（P＜0.05）；与活血调脂方低剂量组比较，活血调脂方中、高剂量组细胞p-IRS-1、p-Akt 表达升高（P＜0.05），p-GSK-3β 的表达降低（P＜0.05）。结果表明，活血调脂方改善了胰岛素的信号传导，使得糖异生减少，肝糖原合成增加，减少了脂肪酸的合成。

图8 活血调脂方对胰岛素信号通路的影响

2.2.4 活血调脂方对脂代谢通路的影响 如图9 所示，与对照组比较，模型组细胞SREBP-1C、SOCS-3、PPARγ 表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，活血调脂方各剂量组细胞Adiponectin、PPARγ 表达升高（P＜0.05），SOCS-3、SREBP-1C 表达降低（P＜0.05）；与活血调脂方低剂量组比较，活血调脂方中、高剂量组细胞SREBP-1C、SOCS-3 表达降低（P＜0.05），Adiponectin 表达升高（P＜0.05），活血调脂方中剂量组PPARγ 表达升高（P＜0.05）。结果表明，活血调脂方减少了脂肪酸的从头合成，增加了脂肪酸的燃烧和能量的消耗，并改善胰岛素抵抗。

图9 活血调脂方对HepG2 细胞脂质代谢通路的影响

3 讨论

细胞实验表明活血调脂方可以增加葡萄糖的摄入改善胰岛素抵抗同时减少肝细胞内甘油三酯的堆积，网络药理学的分析结果提示活血调脂方可能通过胰岛素抵抗、非酒精性脂肪性肝病、PPAR 信号通路这三条通路调节糖脂代谢，胰岛素信号传导路径IRS-1／AKT／GSK-3β 在胰岛素抵抗的发生中起关键作用［13］。脂联素是一种抗炎脂肪因子，可以减少肝糖原生成并增加脂肪酸氧化，有助于治疗和预防糖尿病性脂肪肝，PPARγ 的激活可以显著抑制脂多糖引起的炎症反应，同时增加脂联素的表达［14］。SOCS-3 的过表达可以导致胰岛素抵抗和肝脏脂肪酸合成的关键调节因子SREBP-1C 的增加，对SOCS-3 表达的抑制作用可以改善胰岛素敏感性降低肝脂肪水平和血脂水平［15］。

中医认为糖尿病性脂肪肝其成因可归为内外因2 部分，外因多是贪食高粱肥甘之味，生湿酿痰；内因则主要是脾失健运，肝失疏泄。病位主要涉及肝脾，病久则五脏皆受累，多见脾虚湿盛兼夹血瘀，治宜健脾祛湿，活血降脂。活血调脂方由丹参、荷叶、绞股蓝、西红花、苍术、土茯苓、徐长卿7 味药物组成。丹参是近20 年来中医药治疗糖尿病性脂肪肝使用频次最高的药物［16］，尚涛等［17］发现丹参可在改善胰岛素抵抗基础上进一步改善脂代谢和肝功能。绞股蓝提取液可以通过增强线粒体磷脂的稳定性进而预防脂质蓄积和氧化应激，对糖尿病性脂肪肝患者有益［18］。荷叶可以增强大鼠的脂质代谢并降低血液中甘油三酯水平［19］。苍术的挥发油可以实现体外降血糖，是治疗高血糖的潜在药物［20］。本研究运用网络药理学还发现土茯苓和西红花均含有槲皮素；肉豆蔻酸存在于土茯苓、西红花、徐长卿等药物中；另外西红花中还富含异鼠李素、山柰酚等活性成分。活血调脂方主要组分能够调控GSK3B、INSR、PI3K、PPARγ 等54 个靶点，介导PPAR 信号通路、非酒精性脂肪性肝病、胰岛素抵抗等32 条通路，参与脂肪酸代谢过程、对异源生物刺激的反应、类固醇代谢过程等生物进程从而治疗糖尿病性脂肪肝。本研究通过生物信息学结合体外实验，初步验证了活血调脂方治疗糖尿病性脂肪肝的理论基础。

综上所述，活血调脂方是治疗糖尿病性脂肪肝的一种“多成分，多靶点，多路径”的临床复方，其作用机制主要是改善糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗，本研究为中医复方治疗糖脂代谢紊乱相关疾病提供新思路和新方法，为后续研究复方调控糖尿病性脂肪肝提供新的理论依据并指导临床用药。