基于网络药理学研究益肾消癥方治疗多囊卵巢综合征的作用机制

丁昉黄莉婷何佳林寒梅

（1.广西中医药大学，广西 南宁530020； 2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁530023）

多囊卵巢综合征是一种多基因、多因素、全身性、炎症性的自身免疫性疾病［1-2］，一般由雄激素过多和卵巢功能障碍的体征和症状组合定义，其发病机制尚未完全明确［3］。青春期多囊卵巢综合征具有高发性，其临床症状包括闭经或少经、多毛症、不育症、情绪障碍等［4］，此外对非酒精性脂肪肝、2 型糖尿病、冠状动脉硬化等心血管疾病及子宫内膜癌、卵巢癌等妇科恶性肿瘤的长期风险也不容忽视［5-9］。本课题组在临床使用益肾消癥方发现，其对青春期多囊卵巢综合征患者的疗效优于二甲双胍及达英-35 对照组，且不良反应减少［10］。网络药理学是基于系统生物学、生物信息学及经典药理学等多学科理论对药物干预疾病的靶点及可能机制进行系统归纳分析的新学科［11-12］。本文通过网络药理学方法，构建“药物-成分-疾病-靶点”的交互网络，联合大鼠多囊卵巢综合征模型，对益肾消癥方治疗多囊卵巢综合征的作用靶点及机制进行探究。

1 材料

1.1 网络药理学数据库 中医药百科全书数据库（ETCM，http：／ ／www.tcmip.cn／ETCM／index.php／Home／）；人类基因数据库（GeneCards，https：／ ／www.genecards.org／）；Venny 2.1.0（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny）；String 数据库（https：／ ／string-db.org／）；DAVID数据库（http：／ ／www .david.niaid.nih.gov）；RCSB PDB数据库（https：／ ／www.rcsb.org）；PubChem 数据库（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）。

1.2 试剂与药物 益肾消癥方由党参20 g、仙灵脾12 g、杜仲15 g、菟丝子15 g、女贞子10 g、三棱12 g、莪术10 g、赤芍9 g、胆南星10 g、半夏15 g、夏枯草12 g、当归15 g、川芎10 g、皂角刺12 g、紫石英15 g 等组成，中药材均购自广西省南宁市老百姓大药房，经广西中医药大学黄莉婷老师鉴定为正品。益肾消癥方由广西中医学院中药方剂研究实验室制备，每1 剂（约192 g）浸泡2 h 后加入2 L 水煎煮2 h，取煎煮液。同法煎煮6次，合并所有煎煮液，于60 ℃水浴浓缩至4 g／mL，消毒灭菌，4 ℃保存，备用。丙酸睾酮注射液（批号050601）、0.9%氯化钠注射液（批号07011103）均购自广州白云山明兴制药有限公司；注射用人绒毛膜促性腺激素（HCG，批号0605021），购自上海上药第一生化药业有限公司；枸橼酸氯米芬胶囊（CC，批号060801），购自上海衡山药业有限公司。

1.3 仪器 OHAUS 1／1000 型电子天平［奥豪斯仪器（上海）有限公司］；BCD-143KA1 型电冰箱（TCL 科技集团股份有限公司）；PM-10AD 型照相显微镜（日本Olympus 公司）；Leica MP60 型显微照相系统、RM2125 型LEICA 切片机（德国Leica 公司）。

1.4 动物 SPF 级雌性SD 大鼠40只，体质量30～35 g，23 日龄，由广西医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（桂）2003-0003。饲养条件为室温（25±2）℃，相对湿度40%～70%，12 h／12 h 明暗交替，自由饮水进食。

2 方法

2.1 益肾消癥方有效成分收集及初筛 利用ETCM 数据库收集益肾消癥方中各药味的主要化学成分，并用ETCM 数据库中的MedChem Studio 程序预测查询该化学成分的潜在靶点，保留可靠性分值大于0.8 的靶点。

2.2 疾病靶点预测及交互靶点 以polycistic ovary syndrome 作为检索词纳入GeneCards 数据库中，高级检索获得多囊卵巢综合征相关靶点。通过网络药理学蛋白交集Venny 2.1.0 在线工具取交集获得“益肾消癥方”和“多囊卵巢综合征”交集的“中药-疾病”交互靶点，并绘制韦恩图。

2.3 蛋白互作（PPI）网络构建 将所得到的交互靶点导入，通过String 数据库，限定物种为Homo sapiens，设定最低要求互动分数为“medium confidence”（＞0.4），其余设置均为默认设置，得到PPI 网络相关信息。

2.4 GO 和KEGG 富集分析 将交集靶标导入DAVID 数据库中，进行基因功能富集分析，分别从细胞组成、分子功能、生物过程方面提供基因功能的详细注释。设定阈值P＜0.05 进行筛选，对相互作用的靶点进行GO 富集分析，按照P值升序选取前10 位KEGG 通路，绘制“靶点-通路”弦图。并用R 软件对上述结果进行可视化分析。

2.5 分子对接 从RCSB PDB 数据库下载靶标蛋白，并使用PyMol 软件删除水分子和原配体；有效化合物从PubChem 下载2D 结构，用ChemBio3D 能量最小化转化为三维结构，保存为mol2 格式。以蛋白作为受体，以小分子作为配体，根据靶蛋白复合物中配体的坐标确定分子对接的活性位点，采用AutoDock Vina 进行分子对接，参数exhaustiveness 设置为24，其他参数均采用默认值。最后选取打分值最高的构象用Discovery Studio 进行结果分析，用PyMol 进行相关作图。

2.6 多囊卵巢综合征大鼠造模及给药 参照文献［13］报道，雌性SD 大鼠随机分为正常组、模型组、枸橼酸氯米芬组、益肾消癥方组，每组10只，除正常组外，其余各组建立多囊卵巢综合征大鼠模型，造模方法为颈背部皮下注射丙酸睾酮1.25 mg／只，隔天1次，同时给予HCG 1.5 U／只，每天2 次皮下注射，连续20 d。正常组皮下注射生理盐水0.15 mL／只，每天2次，共20 d。造模成功后，各组大鼠每天灌胃给予相应药物（益肾消癥方组2 g／100 g，枸橼酸氯米组0.5 mg／100 g），共4 周；正常组和模型组大鼠灌胃给予蒸馏水0.5 mL／100 g。

2.7 检测指标

2.7.1 阴道细胞学检查观察动情周期 无菌棉签于生理盐水中浸湿后放入大鼠阴道侧壁上1／3，顺时针涂抹后沿同一方向涂抹于载玻片上，95%乙醇中固定15 min，自然风干后采用HE 染色。大鼠动情周期以阴道内细胞变化来鉴别，动情前期以小、圆、有核鳞状上皮细胞存在为特征，持续时间12 h；动情期以角质化鳞状上皮细胞为特征，持续时间9～15 h；动情后期，以白细胞和角质化细胞为特征，持续时间14～18 h；动情间期，白细胞和圆上皮细胞出现为特征，持续时间60～70 h。

2.7.2 双侧卵巢检测 大鼠腹腔麻醉后摘取双侧卵巢称取湿质量，观察各组大鼠卵巢外观、色泽、包膜及包膜下是否有囊状扩张的卵泡等情况，检测双侧卵巢的体积和质量，用10%甲醛固定液固定后行HE 染色。

2.8 统计学分析 通过SPSS11.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，多组间比较采用One-way ANOVA 分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 益肾消癥方有效化学成分筛选 通过ETCM 数据库检索得到益肾消癥方中包含559 个化合物，这些化合物中可靠性大于0.8 的靶点共计797 个。各药味的化合物和靶点个数见表1。

表1 益肾消癥方包含的化合物和对应的潜在靶标个数

2.2 多囊卵巢综合征靶点预测及“益肾消癥方-多囊卵巢综合征”交互靶点筛选 通过GeneCards 数据库数据，以polycistic ovary syndrome 作为检索词收集得到“多囊卵巢综合征”靶点共计2 575 个。通过网络药理学蛋白交集Venny 2.1.0 在线工具获得“益肾消癥方”和“多囊卵巢综合征”交集的“中药-疾病”交互靶点共252个，韦恩图见图1。

图1 益肾消癥方与多囊卵巢综合征交互靶点韦恩图

3.3 “益肾消癥方-多囊卵巢综合征”交互靶点PPI 网络构建 利用STRING 数据库对交互靶点进行蛋白互作网络分析，绘制PPI 网络图（图2），图中网络节点为251个，相互作用连线有3 054条，平均度值为24.3。节点表示作用靶点，节点间的连线则表示靶点间具有相互作用，互相关联。

图2 交互靶点PPI 网络图

3.4 GO 富集分析 从DAVID 生物信息在线数据库中确定GO 条目867条，其中，生物学过程（biological process，BP）612条，主要涉及对药物、乙醇、缺氧、尼古丁等反应性，氧化还原过程，对RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的起始及正调控，类固醇激素介导的信号通路及代谢过程，突触传递及胆碱能等；细胞组成（cellular component，CC）84条，涉及乙酰胆碱门控通道复合物、胞质溶胶、细胞器膜、质膜、细胞外泌体、膜筏、突触后膜和核苷酸激活的蛋白激酶复合物等；分子功能（molecular function，MF）171条，与药物、酶、乙酰胆碱、血红素、铁离子、氧等结合，类固醇激素受体，乙酰胆碱激活的阳离子选择性通道，配体门控离子通道，乙酰胆碱受体等活性密切相关。以上分析均取排名前10 条目作图，见图3。

3.5 KEGG 富集分析 将疾病和药物交集的关键靶点输入String 数据库，共富集到211 条通路。根据P＜0.05 选取排名前10 的通路作图，见图4。分析富集结果可知，益肾消癥方-多囊卵巢综合征交互靶点涉及雌激素信号通路、神经活性配体-受体相互作用、类固醇激素的合成、胆碱能突触、多巴胺能突触、胰岛素抵抗及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、流体剪切应力与动脉粥样硬化等疾病。

图4 KEGG 富集分析结果（前10）

3.6 分子对接结果 将交互靶点PPI 网络图的TSV 文件导入Cytoscape 3.6.0 软件中分析节点信息，筛选出前6 个核心调控基因靶点，结果见表2。以潜在靶标数＞40 以及ETCM 上类药性（DL）评分＞0.5 作为筛选条件得到主要潜在活性成分，与核心调控基因靶点进行对接，结果发现大部分成分均具有较好对接活性。选取类药性评分最高（0.823），潜在靶标数为44 的乔松素作为代表性成分，与INS（图5A）、ALB（图5B）、Akt1（图5C）进行分子对接进行分析验证。其中，乔松素小分子与INS 蛋白氨基酸Gly20 和Phe24 形成3 个氢键，与氨基酸Phe24 形成2 个ππ 作用；与ALB 蛋白氨基酸Arg117 和Arg186 形成2 个氢键，与氨基酸Tyr138 和Tyr161 形成2 个π-π 作用；与Akt1蛋白的氨基酸Asn279 和Asp292 形成2 个氢键，这些相互作用使得化合物乔松素能与INS、ALB、Akt1 等蛋白形成稳定的复合物，与蛋白的活性口袋有较好匹配。

图5 乔松素与INS、ALB、Akt1 分子对接图

表2 益肾消癥方治疗多囊卵巢综关键靶点拓扑学分析

3.7 益肾消癥方对大鼠动情周期的影响 正常组大鼠均表现为规律动情周期；模型组中11 只大鼠无交替变化的规律动情周期，提示排卵障碍；益肾消癥方组有4 只大鼠表现规律动情周期变化，6 只则呈不规律动情周期变化；枸橼酸氯米芬组中有3 只大鼠呈规律动情周期变化，7 只呈不规律动情周期变化，见表3。

表3 益肾消癥方对大鼠动情周期的影响

3.8 益肾消癥方对大鼠卵巢的影响 正常组大鼠卵巢表面饱满光滑，色泽较红，体积较小；模型组大鼠卵巢表面较苍白，体积增大，包膜增厚，可见包膜下较多囊状扩张的卵泡；益肾消癥方组大鼠卵巢与模型组比较则有明显改善。与正常组比较，模型组大鼠双侧卵巢质量增加（P＜0.01）；与模型组比较，益肾消癥方组大鼠卵巢质量降低（P＜0.01），枸橼酸氯米芬组大鼠卵巢质量降低，但无统计学意义（P＞0.05），见表4。正常组大鼠卵巢结构正常，可见多个黄体及不同发育阶段卵泡，颗粒细胞呈多层，排列整齐；模型组大鼠卵巢可见大量原始卵泡，存在多个囊性窦卵泡，窦腔扩大，颗粒细胞层数减少排列稀疏，黄体组织减少；益肾消癥方组大鼠囊性卵泡壁颗粒细胞层次增加，排列整齐，优势卵泡内见有卵细胞，且黄体数量较模型组的增多，黄体体积增大，见图6。

表4 益肾消癥方对大鼠卵巢的影响（， n＝10）

表4 益肾消癥方对大鼠卵巢的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

图6 各组大鼠卵巢结构图（×100）

4 讨论

多囊卵巢综合征多起病于青春期，以月经失调、高雄激素血症、胰岛素抵抗为基本特征［5，14］。我国传统医学将多囊卵巢综合征归属于“月经后期、闭经、月经过少、崩漏、不孕、癥瘕”等范畴［15-17］。现代中医学多认为该病以脏腑功能失调为本，痰瘀阻滞为标，临床表现多为虚实夹杂，本虚标实之证［18］。

基于多年临床经验及动物实验的基础，林寒梅教授自拟益肾消癥方，方中紫石英、淫羊藿、杜仲补肾壮阳，温暖胞宫为君；菟丝子补阳益阴，女贞子养阴补血，党参益气养血，当归、川芎养血活血，共为臣药，共奏补肾活血之效；三棱、莪术、皂角刺活血化瘀软坚散结；胆南星、半夏、夏枯草化痰散结；赤芍活血散瘀；以上诸药为佐药，配合君、臣药以加强益肾活血、化痰消癥之功［10］。该方已应用于多囊卵巢综合征的临床治疗，取得了良好疗效，为了更好发挥益肾消癥方的治疗作用，本研究采用网络药理学对全方作用机制进行探究。结果显示，益肾消癥方可能通过调控雌激素信号通路、类固醇激素合成、胰岛素抵抗等通路来发挥对多囊卵巢综合征的治疗作用，这与降低体内雄激素的生成、改善胰岛素抵抗和降低胰岛素水平［13］等多囊卵巢综合征治疗的要点相吻合。动物实验发现，益肾消癥方可抑制大鼠卵巢异常增大，增加卵巢黄体组织数量，改善卵巢窦状卵泡卵母细胞多囊样改变，恢复多囊卵巢综合征大鼠动情周期，改善多囊卵巢大鼠的排卵障碍。该治疗机制可能是通过对颗粒细胞和卵泡膜细胞的作用，降低多囊卵巢大鼠雄激素水平，促进卵母细胞生长扩大，与其他因素（如雄激素、胰岛素等）协同或拮抗作用，反馈调节促性腺激素的产生，使卵泡正常成熟发育，恢复排卵。分子对接结果显示，益肾消癥方中主要潜在活性成分乔松素与核心调控基因靶点INS、ALB、Akt1 等结合性较好，其中乔松素可降低NAFLD 大鼠INS 水平，且发挥一定的肝脏保护作用［19］；ALB 是一种主要在肝脏部位合成的结构蛋白，可作为肝脏纤维化程度及肝脏代偿功能的评估指标［20］；Akt1 在胰岛β 细胞增殖中的重要作用已被广泛研究，且Akt1 在卵母细胞、原始卵泡膜细胞、颗粒细胞及黄体细胞中均有表达［21］。乔松素可能作为益肾消癥方中主要活性物质，通过调控胰岛素抵抗途径、调节卵巢生长及成熟来发挥治疗多囊卵巢综合征的作用。

综上所述，益肾消癥方可能以“多成分-多靶点-多通路”的方式通过调控激素合成及胰岛素抵抗来治疗多囊卵巢综合征，后续本课题组将对其活性成分及具体机制进行深入探讨，以期为益肾消癥方在临床治疗中的辨证用药提供科学依据。