基于网络药理学探究附子理中丸治疗溃疡性结肠炎的机制

孙健淇张若琛张颖利解俊杰石妍

（1.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院药学部，内蒙古 包头014030； 2.包头市第九中学，内蒙古包头014000； 3.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院医学整形外科，内蒙古 包头014030； 4.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院党政办公室，内蒙古 包头014030； 5.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院药剂科，内蒙古 包头014010）

溃疡性结肠炎是一种病因尚不确切的非特异性肠道疾病，临床表现为腹痛、腹泻、里急后重及黏液脓血便等，常呈连续慢性炎症反应状态，发作与缓解交替，迁延不愈，根治困难，给患者的生理和精神造成极大困扰。临床治疗常采用氨基水杨酸、糖皮质激素和免疫抑制剂等药物，然而常规治疗难以有效缓解病情和防止复发，还可能引起多种不良反应。因此，探究溃疡性结肠炎的有效治疗方法已成为临床研究的热点［1］。

附子理中丸由附子、干姜、白术、党参、甘草组成，原方出自《阎氏小儿方论》，后收录于《国家基本药物目录》，具有温阳祛寒、益气健脾之功，多用于脾胃虚寒所致脘腹冷痛、呃逆、肠易激综合征［2］，对溃疡性结肠炎的疗效显著［3-4］，作用机制与炎症密切相关。

网络药理学是融合了计算机技术、系统生物学、高通量筛选等技术，研究“药物-靶点-疾病”之间复杂关系的交叉学科，通过对中药多成分、多靶点、多通路、多功能以及中药配伍进行梳理，适合于中药方剂作用机制的研究［5］，已有较多学者通过网络药理学方法预测到中药的治疗靶点［6-7］。本研究采用网络药理学全面解析附子理中丸治疗溃疡性结肠炎的作用机制，以期为溃疡性结肠炎治疗研究提供新的方法与思路。

1 材料与方法

1.1 动物实验

1.1.1 动物及分组 SD 大鼠，清洁级，雄性，体质量220～280 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2019-0010。动物饲养于明暗交替的清洁级动物饲养室中，环境温度24～26 ℃，相对湿度50%。动物实验遵循包头医学院动物伦理委员会规定。将60 只雄性大鼠编号，按随机数字表法分为对照组、模型组和附子理中丸组，每组20 只。

1.1.2 造模及给药 参考文献［8］报道方法，DSS 自由饮用法造模。适应性饲喂养7 d 后将大鼠纳入实验，对照组大鼠给予普通饲料喂养，模型组和附子理中丸组大鼠自由饮用5.0% DSS 水溶液，连续7 d，大鼠出现腹泻、脓血便等症状，表明大鼠造模成功。附子理中丸（批号Z15021454）购自包头中药有限责任公司，研磨后制成0.75 g／mL 混悬液，造模成功后，附子理中丸组给予附子理中丸水溶液灌胃；对照组和模型组给予等量生理盐水，给药量为15 g／kg，每天1次，连续2 周。

1.1.3 一般行为及DAI 评分 造模开始后，在1、3、7、14、21 d 对各组大鼠进行DAI 评分，计算公式为DAI ＝（体质量下降率分数＋大便性状分数＋便血情况分数）／3，评分标准见表1。

表1 DAI 评分标准

1.1.4 标本采集 各组大鼠于末次药物干预后，禁食不禁水24 h，称定体质量，10%水合氯酸（3.5 mL／kg）腹腔注射麻醉，剖开腹腔，自肛门向上截取长度约8 cm 结肠，纵向剪开后用生理盐水冲洗清洁，剪碎后置于无酶冻存管于液氮中保存待测。取材完毕后处死大鼠。

1.1.5 结肠组织病理学检查 取大鼠结肠标本置于组织固定液中固定，制作蜡块、脱水、HE 染色，显微镜下进行病理学检查。

1.2 网络药理学分析

1.2.1 附子理中丸的活性成分及作用靶点 应用TCMSP 2.3 数据库［9］（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）获得附子理中丸中附子、党参、炒白术、甘草、干姜的活性化合物信息，活性化合物筛选条件设为经口服生物利用度（OB）≥30 %，类药性（DL）≥0.18。预测活性化合物作用靶点采用Swisstarget prediction 数据库（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch），导入活性化合物SMILES ID 进行预测，保存预测靶点信息。

1.2.2 溃疡性结肠炎靶点 应用DISGENET 5.0 数据库［10］（http：／ ／www.disgenet.org／），以“Ulcerative colitis”为关键词，找到溃疡性结肠炎疾病相关靶点，删除重复靶点及靶点-疾病相关性得分小于0.01 的靶点，与“1.2.1”方法中所获得的附子理中丸预测靶点相匹配，得到附子理中丸治疗溃疡性结肠炎的作用靶点。

1.2.3 VENNY 图的制作 使用DrawVennDiagram 网站（http：／ ／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）将5 味单味药及其溃疡性结肠炎相关靶点导入，应用Venn diagram网站（http：／ ／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）制作VENNY图，找到多个单味药共同作用的靶点。

1.2.4 GO 分析及KEGG 分析 应用Cytoscape 2.3.5 软件中Clue GO 插件将附子理中丸治疗溃疡性结肠炎靶点uniprot ID 导入，设置物种，选择“GO 生物过程分析及KEGG 通路分析”，设置P值＜0.05，提交获得相关结果。GO 生物过程分析结果应用气泡图展示，KEGG 通路分析结果应用Cytoscape 进行可视化处理。

1.2.5 关键节点选择 应用Cytoscape 软件对KEGG 分析结果构建网络，利用cytoHubba 插件对靶点进行排序，cytoHubba 应用的是Maximal Clique Centrality 方法，其综合11 个拓扑分析方法和6 个中心性方法，可综合多种因素选择关键靶点。

1.2.6 分子对接验证 选择关键靶点蛋白及其作用活性化合物，将下载的活性化合物结构式导入薛定谔Maestro中，优化所有小分子结构，预测其质子化状态，生成立体异构体。在PROTEIN DATA BANK 数据库（https：／ ／www.rcsb.org）中下载蛋白结构式，将靶点蛋白导入软件中，对其进行加氢原子、去水分子和杂原子集团等处理，简单优化蛋白。对蛋白进行定义对接区域，生成格点文件，把处理好的小分子与定义的格点文件进行对接。

1.3 靶点验证 Western blot 检测NF-κB1（p50）、NF-κB3（p65）、TNF-α、IL-6、MAPK1 蛋白表达。使用RIPA 裂解液从结肠组织中提取总蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度，计算蛋白上样量，进行电泳，转膜，封闭，一抗NF-κB1、TNF-α、IL-6（美国Proteintech 公司）和NF-κB3、MAPK1（英国Abcam 公司）孵育，洗膜，二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）孵育，洗膜，曝光扫描，并利用Image J软件进行数据分析。

1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0 软件处理，计量数据以（）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，方差齐采用SNK-q检验，方差不齐采用Game-Howell 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物实验DAI 评分及大鼠结肠组织病理形态观察如表2 所示，自开始造模为1 d 起算，模型组和附子理中丸组在7 d 评分最高，表示造模成功。用药2 周后，与模型组比较，附子理中丸组大鼠症状好转（P＜0.01）。如图1所示，对照组大鼠结肠组织结构完整，未见溃疡形成；模型组大鼠发现的结构破坏，溃疡形成，组织大量炎性细胞浸润；附子理中丸组发现溃疡愈合，炎性细胞浸润减少。

表2 各组大鼠不同时间点DAI 评分（， n＝20）

表2 各组大鼠不同时间点DAI 评分（， n＝20）

注：与模型组比较，＃＃P＜0.01。

图1 各组大鼠结肠组织形态（HE 染色，×50）

2.2 网络药理学预测

2.2.1 靶点预测 为寻找附子理中丸的成分，应用TCMSP数据库检索到相关活性化合物信息，并下载其分子结构式。在Swisstarget 数据库中基于分子结构预测附子理中丸的潜在靶点，并将靶点与溃疡性结肠炎的靶点进行对比，重复部分为预测的治疗靶点，整理靶点信息，得到潜在靶点76个，见表3。

表3 附子理中丸治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点

续表3

2.2.2 VENNY图如图2 所示，预测结果中多数靶点可与多种药物作用，其中脂肪酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，FAAH）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）、维生素D 受体（vitamin D receptor，VDR）、过氧化物酶体增殖物激活受体α／β（peroxisome proliferator activated receptorα／β，PPARA）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）等与溃疡性结肠炎密切相关的靶点可与5 味药共同作用。

图2 药物-潜在靶点韦恩图

2.2.3 靶点分析 GO 富集生物过程分析结果如图3 所示，靶点主要参与调节白细胞介导的细胞毒性、血管生成的正调控、树突细胞趋化性、对铵离子的反应、调控自噬等多种生物过程，气泡图中Y 轴代表生物过程名称，X 轴代表靶点在生物过程中的比例，气泡颜色代表P值，节点大小代表参与生物过程的靶点数；KEGG 通路分析结果如图4 所示，靶点涉及Toll 样受体（toll like receptors，TLR）信号通路、NOD 样受体（nucleotide binding oligomerization domain like receptors，NLR）信号通路、Janus 激酶／信号转导与转录激活子（the Janus kinase／signal transducer and activator of tran-ions，JAK／STAT）信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、白介素-17（interleukin -17，IL-17）信号通路、Th1 和Th2 细胞分化、Th17 细胞分化、T 细胞受体信号通路、TNF-α 信号通路等，均与溃疡性结肠炎密切相关，图中蓝色节点为靶点，红色节点为通路，共80 个节点，438条边。

图3 附子理中丸靶点参与的生物过程

图4 靶点-通路图

2.2.4 关键节点选择及分子对接 基于靶点通路图，应用Cytoscape 软件的cytoHubba 插件对靶点进行分析，确定关键靶点为MAPK1、NF-κB1、TNF-α、IL-6、NF-κB3，其自由度和临近靶点数量等参数均优于其他靶点。找到作用于关键靶点的活性化合物成分，应用Maestro 进行分子对接，对接结果中“吉布斯自由能绝对值＞5”为有效对接。结果如图5 所示，其中5 个关键靶点可与不同成分作用，证明其作为溃疡性结肠炎潜在靶点的可行性。

图5 分子对接结果图

2.3 关键靶点的验证 如图6 所示，与模型组比较，附子理中丸能够降低NF-κB1 p50、TNF-α、IL-6、NF-κB3 p65 的蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01），而对MAPK1 蛋白表达无影响（P＞0.05），表明附子理中丸能够通过NF-κB1 p50、TNF-α、IL-6 及NF-κB3 p65 靶点发挥保护作用。

图6 附子理中丸对潜在靶点蛋白表达的影响

3 讨论

附子理中丸具有温阳祛寒、益气健脾之功，多用于脾胃虚寒所致脘腹冷痛、呕吐泄泻、手足不温等症，临床使用广泛。胡利群等［11］应用附子理中丸联合五维他口服溶液治疗溃疡性结肠炎，可改善疾病症状。附子理中丸疗效确切，作用迅速，但对其治疗溃疡性结肠炎的基础研究尚不多见。

采用DSS 制备大鼠溃疡性结肠炎模型，发现给予附子理中丸能够缓解症状，促进溃疡愈合，减少组织炎性细胞浸润。网络药理学分析发现，附子理中丸主要通过参与上皮细胞凋亡过程、调控自噬、平滑肌收缩的积极调节、急性炎症反应的调节等生物过程来干预疾病的发生发展，反映出复方多途径的特点；参与调控的通路有NF-κB 信号通路、TNF-α 信号通路、T 细胞受体信号通路、Toll 样受体信号通路、Th1 和Th2 细胞分化、Th17 细胞分化等，且均与炎症密切相关，由此推测附子理中丸可能主要通过调控各种信号因子发挥抗炎作用。结合多种分析结果，最终筛选到附子理中丸治疗溃疡性结肠炎的关键靶点为MAPK1、NF-κB1、TNF-α、IL-6、NF-κB3。

小肠上皮细胞中IL-8 的产生依赖ERK1／2 通路［12］，而IL-8 在结肠免疫系统中发挥潜在作用［13］，但本实验结果发现，附子理中丸不能对该靶点蛋白表达发挥作用，表明MAPK1 可能不是其治疗靶点。关键靶点中TNF-α、IL-6 作为重要的炎症介质，其表达升高会导致细胞因子失衡，参与疾病的发生发展。在柳氮磺吡啶联合双歧杆菌三联活菌胶囊治疗溃疡性结肠炎的研究中发现，药物可通过降低炎症因子的表达恢复机体自身免疫，从而纠正溃疡性结肠炎病理过程中出现的细胞因子紊乱［14］。本实验研究发现，溃疡性结肠炎中存在TNF-α、IL-6 的高表达，表明其作为治疗靶点的可行性。

NF-κB 是一种重要的调节因子包括NF-κB1 p50、NFκB2 p52、RE-LA p65、RELB 和c-REL 等5 个成员，它们以同型和异型二聚体的各种组合形式存在［15］。在大多数细胞中，NF-κB 存在的主要形式是由RE-LA 和NF-κB1 组成的异二聚体［16］，其中，NF-κB1 负责与DNA 结合，RE-LA 参与调控下游多种靶基因的转录活性［17］。Hegazy等［18］研究表明，溃疡性结肠炎患者的肠黏膜TNF-α 和RE-LA ／p65 高表达，通过降低IL-6、TNF-α 和p65 表达，可以减轻炎症反应，改善黏膜状态。国外学者通过抑制NF-κB 亚基（p65 ／p50）的激活和转运，抑制了溃疡性结肠炎患者肠黏膜的炎性改变，起到保护肠黏膜的作用［19］，这提示附子理中丸可通过该途径起到保护和修复黏膜的作用。本实验验证发现，附子理中丸可降低NF-κB1、TNF-α、IL-6、NF-κB3 蛋白表达，对溃疡性结肠炎起到保护作用。

综上所述，附子理中丸可通过多途径、多靶点来治疗溃疡性结肠炎，在靶点间同样存在协同作用。本研究全面分析了附子理中丸治疗溃疡性结肠炎的机制，为临床指导用药提供了新的理论依据，也为今后继续探索中药附子理中丸的作用机制提供了新线索。