基于分子对接的玉屏风中端粒酶TERT 激动剂的虚拟筛选

汤建朱锐灵赵康琦夏海平闻崇炜

（1.亳州学院中药学院，安徽 亳州236800； 2.江苏大学药学院，江苏 镇江212013； 3.江苏大学附属四院神经内科，江苏 镇江212001）

玉屏风系中医扶正固本的经典名方，由黄芪、白术和防风组成，诸药合参，药简效宏［1］，具有抗衰老的可能性［1-2］。玉屏风能明显地延长果蝇的平均寿命，对BJ 细胞中的端粒酶有较好的激活作用，其抗衰老作用可能与端粒酶激活有关［3］。玉屏风中化学成分繁杂，关键活性成分和激活端粒酶的机制尚不明确。

端粒酶是端粒复制所必须的一种特殊的DNA 聚合酶，若激活端粒酶，可增加细胞分裂次数，从而延长细胞寿命［4-5］。端粒酶逆转录酶（TERT）是端粒酶的限速亚单位，是端粒酶活性调节的关键基因，针对TERT 的活性成分筛选是发现端粒酶激动剂（抗衰老）或抑制剂（抗癌）的有效方法［6-7］。目前靶向端粒酶或TERT 的研究以筛选端粒酶抑制剂居多［7］，而激动剂的研究较少，环黄芪醇是目前唯一被公认的通过激活端粒酶发挥抗衰老作用的天然膳食补充剂［5-6］。为发现更多潜在的抗衰老活性化合物，以端粒酶TERT 基因为靶蛋白，采用分子对接技术从传统中药玉屏风中虚拟筛选激动TERT 的活性成分。

分子对接是利用计算机软件模拟小分子配体与大分子受体之间活性位点的最佳结合模式的技术，在中药活性成分筛选和靶点确证方面有着广泛的应用前景［8-9］，与网络药理学联用在中药多组分、多途径发挥药效的解析工作中发挥了重要作用［10］。本研究采用AutoDock Vina 软件［11］，将检索到的玉屏风中的小分子化合物与端粒酶TERT 基因进行分子对接，根据打分虚拟筛选出潜在的端粒酶激活剂，为阐明玉屏风的抗衰老活性机制提供科学依据。

1 材料

采用ChemOffice2020 程序（美国PerkinElmer 公司）中的ChemDraw 和Chem 3D模块、AutoDock Tools1.5.6 和AutoDock Vina（斯克利普斯研究所）、Pymol 1.8（美国DeLano Scientific LLC公司）和Discovery Studio 2017R2 client（美国BIOVIA 公司）。

2 方法

2.1 靶蛋白TERT 结构的获取和预处理 通过检索搜索PDB 结构数据库（http：／ ／www.rcsb.org／pdb／home／home.do），获取靶点蛋白TERT 复合物（PDB ID：5CQG），将靶点蛋白依次导入AutoDock Tools1.5.6中，删除原配体BIBR1532，水分子，加氢，保存为pdbqt 格式，以备分子对接。

2.2 化合物（配体）库的建立 通过检索PubChem 等数据库［12］和相关文献，从玉屏风的水煎剂以及3 种原药材黄芪、白术和防风中共收集68 个化合物（配体），主要为三萜皂苷、黄酮、白术内酯、色原酮、香豆素等化合物，见表1，ChemDraw 软件绘制分子结构，并用Chem3D 转化成三维结构，MM2 力场进行最小能量优化，结果保存为mol2格式。AutoDock Tools1.5.6 对小分子进行加氢，计算Gasteiger 电荷，合并非极性氢，最终保存为pdbqt 格式，以备分子对接。

表1 玉屏风中68 个小分子化合物

2.3 配体-靶蛋白的分子对接 在对接前，须确定验证对接过程中参数设置的合理性。首先用AutoDock Tools 1.5.6软件将靶点蛋白晶体复合物中的原配体取出，利用AutoDock Vina 与受体重新对接，其结合能打分值为阈值，同时分析对接构象和原蛋白晶体结构中的构象的重叠度，通常认为均方根偏差（RMSD）在2Å 范围内。

分子对接的晶格中心设置为x＝24.667，y＝6.99，z＝-31.485（nm），对接空间（Grid Box）：30 nm×30 nm×30 nm，能量范围为4。利用Vina 软件进行半柔性对接（对接过程中受体是刚性，配体是柔性，可在一定范围内变化），得到配体分子与靶点蛋白（PDB ID：5CQG）对接后的能量打分值。

3 结果

通过分子对接，均选择序号1 的打分值（dist from rmsd l.b.值和best mode rmsd u.b.值均为0），见表2。发现68个化合物的对接分值与结构有明显的相关性。其中异黄酮类（20～25）以及异黄烷醇类（26～27）等化合物具有最强的结合力（≥-9.0 kcal／mol）；色原酮类化合物（41～52）具有较强的结合力（-8.1～-9.1 kcal／mol）；大部分白术内酯类和香豆素类具有中等强度的结合力，但双白术内酯（39）和双表白术内酯（40）与TERT 的结合力较强，分值为-9.2、-9.9 kcal／mol。紫花前胡苷元（63）和异紫花前胡苷（64）也表现出较高的结合力，分值分别为-9.0、-9.5 kcal／mol；黄芪皂苷类化合物（1～19）结合力普遍偏弱，大部分黄芪皂苷物质的分值在-7.0～-7.4 kcal／mol。所有化合物与TERT 的对接分值均低于原配体BIBR1532（-10.7 kcal／mol）。

表2 化合物与受体蛋白TERT 的结合能（kcal／mol）

玉屏风68 个化合物中，打分值最高的是毛蕊异黄酮苷（20）和芒柄花苷（22）。3D 图显示毛蕊异黄酮苷的分子卡在蛋白5CQG 的凹槽内（图1A）。2D 图中可见化合物与残基GLY553、PHE478 和TRP498 形成范德华力；糖片段的3-OH 与残基ARG557、GLY495 形成氢键；黄酮苷元的A、C 环与残基MET482 之间，B 环与残基MET483 之间形成π-硫键；A、C 环与残基TYR551 之间，A、B、C 环与残基PHE494 之间形成π-π 键；分子还与残基LEU554、ILE497和ILE550 形成π-烷基键（图1B）。图1C 显示，芒柄花苷的分子与蛋白5CQG 有着类似的结合方式，芒柄花苷与残基PHE478、GLY495、ARG557 和GLY553 形成范德华力；糖片段的3-OH 与残基TRP498 形成氢键；黄酮苷元的A、C 环与残基MET482 之间，B 环与残基MET483 之间形成π-硫键；A、C 环与残基TYR551 之间，A、B、C 环与残基PHE494 之间形成π-π 键；分子还与残基ILE497、LEU554和ILE550 形成π-烷基键（图1D）。毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷与蛋白的结合紧密，存在着作用明显的作用力，这也很好地解释了这两个化合物与TERT 的结合力最强的原因。

图1 毛蕊异黄酮苷（A、B）和芒柄花苷（C、D）与TERT（5CQG）的对接示意图

4 讨论

玉屏风为扶正固本经典名方，对机体的免疫功能具有双向调节作用，在抗疲劳、抗衰老等方面均具有良好的应用前景。原药材黄芪的主要活性成分为皂苷、黄酮和多糖；白术的化学成分主要是挥发油、内酯类化合物、苷类化合物以及多糖；防风的化学成分主要为色原酮类化合物、香豆素、挥发油、聚炔和多糖等。虽然通过色谱手段分离鉴定了大量的天然小分子化合物，其中白术中分离得到的倍半萜类化合物就有100 多种，但玉屏风的水煎剂中通过LCMS 等手段，仅仅发现了10 余种成分，其中白术药材中只有3 种成分进入水煎剂。以玉屏风水煎剂中的15 个化合物为主要成分，经适当扩充，选择了68 种小分子化合物进行研究，其中30 种源于黄芪，10 种源于白术，28 种源于防风。虽然多糖成分具有良好的免疫增强等活性，但其化学结构尚不能确定，不适合进行分子对接［9］。目前PDB 数据库中还未收录人类端粒酶逆转录酶（hTERT）的结晶结构，因此以高度近似的昆虫赤拟谷盗（Tribolium castaneum）TERT 基因为模板进行分子对接［7］。又因目前尚无TERT 基因与其激活剂的结晶复合物，故本文中使用赤拟谷盗TERT基因与抑制剂BIBR1532 结晶复合物（PDB ID：5CQG）作为对接蛋白［7，13］。

68 个化合物中，有些化合物与TERT 对接打分值和实验药理活性的差距较大。环黄芪醇能够明显地增加TERT表达而激活端粒酶［5-6］。前期筛选端粒酶激活剂研究中发现，黄芪甲苷具有温和的激活端粒酶的活性，能促进BJ 细胞生长，只是弱于其苷元环黄芪醇。但本文中环黄芪醇与TERT 对接的分值为-7.7 kcal／mol，其糖苷化合物（黄芪甲苷）的对接分值仅为-7.1 kcal／mol，属中等强度。人参炔醇和法卡林二醇在细胞模型中均表现出良好的细胞毒活性［14-15］，推测其与TERT 可能有较高的结合力，但分子对接结合力较弱，分值仅为-6.8、-5.9 kcal／mol。

对接的分值较高，说明化合物与TERT 的结合力较强，但不能确定是激活剂还是抑制剂。如毛蕊异黄酮的结合力为-10.2 kcal／mol，但实验证明，该物质既有良好的抗肿瘤活性，又有显著的抗衰老活性［16］。药效的表达不是简单的抑制或激活，而是一个复杂的调节过程。

综上所述，玉屏风具有良好的激活端粒酶能力，在抗衰老等方面具有良好的应用潜力，其活性物质可能通过TERT 激活端粒酶。分子对接只能预测化合物与靶酶TERT的结合力，但这些化合物是激动剂还是抑制剂还需要细胞或动物实验确证。