基于GC/HPLC检测和苦味评定解析黄酒苦味

陈文颖，周世水*，闫统帅，郭 波

（1.华南理工大学 生物科学与工程学院，广东 广州 510006；2.广东石湾酒厂集团股份有限公司，广东 佛山528031）

黄酒是世界三大古酒之一，是中华民族的瑰宝，其富含蛋白质、氨基酸和多糖等营养物质以及活性多肽、功能多糖、维生素、γ-氨基丁酸、类黑精等生理活性物质[1]，这赋予黄酒一定的营养保健功能。

苦味是黄酒的基本风味之一，适当的苦味给人以爽口的感觉[2]，但是市面上大部分黄酒口感不够“爽”，苦味重，持续性强，使得黄酒口感粗糙[3]，销售人群受限而导致我国黄酒销售量人均约2 L[4]。目前，葡萄酒[5-6]、清酒[7-8]、白酒[9-10]和啤酒[11-12]的苦味物质在国内外都有比较系统的研究，但是黄酒的苦味物质研究相对较少，其中于海燕等[13]提出黄酒中的苦味主要由高级醇、氨基酸、苦味肽和黄酒发酵不正常时产生的丙烯醇、酪醇引起。黄酒中苦味物质的探究常采用分离纯化黄酒中的物质逐一进行感官评定，这种方法前处理样品方式复杂，且忽略了黄酒中各物质相互作用的影响[14]。2008年，有研究者首次将核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）测定葡萄酒数据并运用代谢组学的方法来进行分析，这打开了酒代谢组学的大门[15]。随后，学者们利用酒代谢组学结合数据统计分析方法如主成分分析（principal component analysis，PCA）、层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）等数据统计分析方法探究酒的风味[16]、品质评价模型[17]以及酒龄[18]等特征，使得酒中越来越多的奥秘被揭开，这些方法为分析影响黄酒苦味的因素提供了思路。因此，本研究通过使用气相色谱（gas chromatography，GC）和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定黄酒中挥发性成分、氨基酸和理化性质，结合苦味评定进行相关性分析和PLSR分析来确定黄酒中的各组分与苦味的关系。以期为降低黄酒苦味的酿造技术、开发优良口味黄酒提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20种半干型黄酒（糖度15.1～40.0 g/L、酒精度12%vol～20%vol、编号HJ1～HJ20）：浙江绍兴、宁波等7家酒厂市售产品；甲醇、乙醛、正丙醇、乙酸乙酯、异丁醇、异戊醇、乳酸乙酯、丁酸、β-苯乙醇、酒精、丙酮、乙酸丁酯、乙腈、正己烷、异硫氰酸苯酯（均为色谱级）、氨基酸标准品（纯度均＞98%）、盐酸奎宁（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

GC8100气相色谱仪（GC）、LZP-930色谱柱（30 m×0.32 mm×1 μm）：滕州中科普仪器有限公司；LC-10A高效液相色谱仪（HPLC）：日本岛津公司；安捷伦TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：安捷伦科技（中国）有限公司；pH酸度计：梅特勒-托利多国际贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 挥发性成分的测定

黄酒中挥发性成分采用GC法测定[19]。按照各组分标准品保留时间进行定性，内标法进行定量。测定挥发性成分的内标为17.6 mg/mL乙酸丁酯。样品过0.22 μm 孔径滤膜，将980 μL样品和20 μL丙酮（内标）置于气相色谱样品瓶中。柱箱升温程序：先以50 ℃保持5 min，再以10 ℃/min的速度升温至200 ℃并保持5 min。进样口温度220 ℃，检测器温度230 ℃，载气为高纯氮气（N2），载气流速30 mL/min，氢气流速30 mL/min，空气流速300 mL/min，尾吹氮气速度30 mL/min，进样体积0.4 μL。

1.3.2 氨基酸含量测定

氨基酸采用HPLC法[20]测定。取酒液200 μL加100 μL 1.2%异硫氰酸苯酯乙腈溶液和100 μL 14%三乙胺乙腈溶液，混匀后静置1 h，加入400 μL正己烷，旋涡混合器振荡60 s后静置10 min，取下层清液过0.45 μm 孔径滤膜后备用。HPLC色谱条件为安捷伦TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A：0.01 mol/L 乙酸钠缓冲液-乙腈（97∶3，V/V）；流动相B：乙腈-水（4∶1，V/V）；流速1.0 mL/min；检测波长254 nm；柱温40 ℃；进样量10 μL。洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.3 黄酒理化指标的测定

黄酒的总酸（以乳酸计）、总糖（以葡萄糖计）：按照GB/T 13662—2018《黄酒》测定；黄酒中酒精含量采用GC法测定并稍作改动[21]。按照乙醇保留时间进行定性，内标法进行定量。测定酒精含量的内标为7.32 mg/mL丙酮。样品过0.22 μm 孔径滤膜，将100 μL样品、800 μL水和100 μL内标丙酮置于气相色谱样品瓶中。柱箱升温程序：先50 ℃保持4 min，再30 ℃/min的速度升温至200 ℃并保持2 min。进样口温度220 ℃，检测器温度230 ℃，载气为高纯氮气（N2），载气流速30 mL/min，氢气流速30 mL/min，空气流速300 mL/min，尾吹氮气速度30 mL/min，进样体积0.4 μL。

1.3.4 苦味值的评定

苦味评定方法[22]。苦味标准液：用柠檬酸将纯净水调至与原酒pH（3.8～4.2）一致，用此作为标准溶液基液；将盐酸奎宁配制为不同浓度的苦味标准品，以此为标准进行评分。盐酸奎宁质量浓度5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L和40 mg/L分别对应苦味值5、10、20、30和40。

采用标签量值评估法[23]对成员（5男5女；年龄22～50岁）进行为期两个月的口味敏感性训练，以2 mg/L盐酸奎宁为苦味标准物训练苦味。训练后所有的评定员都可以准确识别苦味。每次评定前1 h内限制饮食，评定员用蒸馏水漱口后，准确移取10 mL待测样品于口腔中充分浸润5～10 s，仰头让样品浸润咽喉部位两次，保证样品覆盖整个咽喉的表面后吐出，漱口，不同样品之间间隔不低于3 min，每个样品评定3次，评定员确定与样品最接近的苦味标准液并以此确定苦味值。

1.3.5 相关性分析

Pearson相关系数法常用于评估2个连续变量之间的线性关系。将各测定成分含量与苦味值进行Pearson相关性分析，通过选择双变量相关分析中的Pearson和双侧检验方法，获取相关系数。

1.3.6 PLSR苦味分析

将测定各成分作为X变量，苦味值作为Y变量，进行PLSR分析，包括数据的降维和苦味值识别的分析，建立模型并用模型预测苦味值Y。

1.3.7 统计数据分析

采用SPSS 24.0进行数据的统计学分析、相关性分析；条形图由Graphpad prism 8.0软件分析绘制；PLSR分析由The Unscrambler X 10.4软件分析。除方法中特别说明外，各试验设定3个平行，数据用“平均值±标准偏差”表示。

2 结果与分析

2.1 黄酒中挥发性成分测定结果

黄酒样品中挥发性成分、酒精度的测定结果见表2。由表2可知，黄酒中主要挥发性成分及含量为乙醛19～98mg/L、甲醇0～40 mg/L、正丙醇38～122 mg/L、乙酸乙酯31～158 mg/L、异丁醇61～132 mg/L、异戊醇108～238 mg/L、乳酸乙酯121～580 mg/L、丁酸63～714 mg/L、β-苯乙醇13～200 mg/L。其中高级醇含量最高的是样品HJ2 578 mg/L，最低的是样品HJ12 242 mg/L。乙酸乙酯含量最高的是样品HJ16 158 mg/L，最低的是样品HJ1 31 mg/L。乳酸乙酯含量最高的是样品HJ5 580 mg/L，最低的是样品HJ13 121 mg/L。

表2 黄酒样品中挥发性成分含量测定结果Table 2 Determination results of volatile components contents in Huangjiu samples mg/L

2.2 黄酒中氨基酸含量的测定结果

黄酒中氨基酸的测定结果见表3。由表3可知，各黄酒样品中一共检出18种游离氨基酸，包含8种必需氨基酸和10种非必需氨基酸。黄酒中必需氨基酸总量在332～2 172 mg/L，必需氨基酸总量最高的是样品HJ8，为2 172 mg/L；最低的是样品HJ5 为332 mg/L。黄酒中苦味氨基酸总量在458～2269mg/L，苦味氨基酸总量最高的是样品HJ8，为2269mg/L；最低的是样品HJ5，为458 mg/L。多数苦味氨基酸如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸也是必需氨基酸，相对而言，黄酒中苦味氨基酸总量比必需氨基酸总量多。黄酒中游离氨基酸总量在1 110～4 924 mg/L，游离氨基酸总量最高的是样品HJ8，为4 924 mg/L；最低的是样品HJ5为1 110 mg/L。酒样中氨基酸含量有差异，其中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸含量均较高，这与宫晓波等[24]的研究结果相一致。

表3 黄酒样品中氨基酸含量测定结果Table 3 Determination results of amino acids contents in Huangjiu samples mg/L

续表

2.3 黄酒理化指标测定

黄酒样品中总酸、总糖和酒精含量测定结果见表4。由表4可知，黄酒中总酸含量3.6～8.2 g/L，符合半干型黄酒GB/T 13662—2018《黄酒》标准（稻米黄酒3.0～7.5 g/L，非稻米黄酒3.0～10.0 g/L）。总糖含量14.5～44.0 g/L，仅样品HJ4总糖含量14.5 g/L略低于半干型黄酒标准，样品HJ7总糖含量44.0 g/L略超半干型黄酒标准，其他均符合半干型黄酒GB/T 13662—2018《黄酒》标准（15.1～40.0 g/L）。酒精含量9.5～15.1 g/L，即酒精度为12.0%vol～19%vol，符合半干型黄酒GB/T 13662—2018《黄酒》标准（＞8.0%vol）。

表4 黄酒样品理化指标测定结果Table 4 Determination results of physicochemical indexes of Huangjiu samples g/L

2.4 黄酒苦味值分析

黄酒样品苦味值的测定结果见图1。由图1可知，样品HJ1和HJ5的苦味值最高，都为40；其次是样品HJ2的苦味值为36；样品HJ3和HJ4的苦味值为34、样品HJ8、HJ11、HJ15和HJ16的苦味值为32；样品HJ9的苦味值为24；样品HJ10的苦味值为20；样品HJ6、HJ13的苦味值为18；样品HJ12、HJ14的苦味值为16；样品HJ7的苦味值最低，为14；其中苦味值＜25的黄酒样品有7种，占44%，苦味值＞30的黄酒样品有9种，占56%。经品评可以发现，黄酒苦味值相差2个单位在品评过程中就会有显著性差异，黄酒的苦味值在该品评标准下8～34为宜，苦味值低于8的黄酒其酒特征不明显，有些甚至很寡淡，不具有酒的风味。苦味值高于34的黄酒苦味较重，难以吞咽甚至产生不愉悦感。黄酒的苦味值差异主要由于黄酒各组成成分不同而引起[25]，通过探究黄酒样品中挥发性成分、氨基酸及理化指标与苦味的相关性，从而得以从菌种、原料组成和发酵工艺来控制黄酒发酵过程中各组成成分的产生[22]，降低黄酒苦味并提升黄酒品质。

图1 黄酒样品的苦味值测定结果Fig.1 Determination results of bitterness values of Huangjiu samples

2.5 黄酒中挥发性成分、氨基酸及理化指标与苦味值相关性结果分析

黄酒中挥发性成分、氨基酸及理化指标与苦味值相关性分析结果见图2。由图2可知，苦味值与异戊醇（R=0.808）、异丁醇（R=0.642）、正丙醇（R=0.623）显著正相关，这与高级醇是酒的苦味来源结果一致[13，22，26-27]。乳酸乙酯（R=0.771）作为一种呈香物质，是黄酒的重要香气成分，但乳酸乙酯含量过高便会抑制酒的整体香气并产生明显苦涩感[28]。因乳酸乙酯在半干型黄酒中含量较高（121～549 mg/L）且超过了自身的苦味阈值（70 mg/L）[26]，所以其在增香的同时也会产生一定的苦味。

图2 黄酒样品中挥发性成分、氨基酸及理化指标与苦味值相关性分析结果Fig.2 Correlation analysis results between volatile components,amino acids,physicochemical indexes and bitterness value of Huangjiu samples

通常黄酒中苦味氨基酸占总氨基酸44%，会给黄酒带来一定程度的苦味[3，13，26]，其中部分氨基酸与苦味值呈弱正相关，包括精氨酸（R=0.464）、缬氨酸（R=0.414）、脯氨酸（R=0.376）、亮氨酸（R=0.321）、异亮氨酸（R=0.296）、苯丙氨酸（R=0.246）等苦味氨基酸，其他氨基酸与苦味相关极小或负相关，特别是甘氨酸（R=-0.536）与苦味呈显著负相关。由于氨基酸的感官阈值较高[26]，且氨基氮与苦味呈现负相关而与鲜味正相关[29]，这可能是导致黄酒中氨基酸与苦味相关性低的原因。

此外，总酸（R=0.641）对苦味有促进作用，总糖（R=-0.735）对苦味有明显抑制作用，糖是一种传统的苦味掩盖物[30]，在黄酒的风味中同样也发挥了巨大作用。酒精与苦味值呈极显著正相关（R=0.850），而且酒精浓度越高，苦味越强烈，这与CHEN T等[31]的高浓度酒精会产生强烈的苦味结论相一致。

2.6 偏最小二乘法回归分析模型建立

不同黄酒样品中挥发性成分、氨基酸及理化指标与苦味值相关性偏最小二乘法回归分析载荷图见图3。PLSR可进一步验证Pearson相关性分析的物质来建立苦味与测定成分之间的可靠性。以各测定成分为X预测变量，苦味值为Y响应变量进行PLSR分析，提取两个主成分，主成分1解释了31%的X方差、73%的Y方差，主成分2解释了31%的X方差、解释了16%的Y方差，两个主成分共解释了62%的X方差、89%的Y方差。由图3可知，位于2个椭圆之间的成分如酒精度、异戊醇、异丁醇、正丙醇、乳酸乙酯和绝大部分的氨基酸均能很好的被PLSR模型解释，酒精度、异戊醇、异丁醇、正丙醇、乳酸乙酯等与苦味值距离较近，表明相关程度高，而氨基酸类物质与苦味值距离较远，表明相关程度低。这也与邱修柄等[22]的研究中高级醇比苦味氨基酸更能决定苦味强度的结果相同。苦味值位于内椭圆，对PLSR模型总方差贡献显著，能很好的被相关性高的测定成分解释。

图3 黄酒样品中挥发性成分、氨基酸及理化指标与苦味值的偏最小二乘法回归分析载荷图Fig.3 Load diagram of partial least squares regression analysis of volatile components,amino acids,and physicochemical indexes in Huangjiu samples and bitterness value

不同黄酒样品中挥发性成分、氨基酸及理化指标与苦味值相关性偏最小二乘法回归分析得分图见图4。由图4可知，随着苦味值的增大，其主成分1得分值和主成分2得分值呈现逐渐增大的趋势，不同苦味值的黄酒能明显区分开来。且所有样本都落在95%的置信区间内，无异常值，这表明黄酒成分与苦味值对应关系分析结果是可信的。

图4 黄酒样品中挥发性成分、氨基酸及理化指标与苦味值的偏最小二乘法回归分析得分图Fig.4 Score plot of partial least square regression analysis of volatile components,amino acids,physicochemical indexes and bitterness value of Huangjiu samples

2.7 黄酒苦味值偏最小二乘法回归预测模型的验证

为了定量预测黄酒样品中挥发性成分、氨基酸及理化指标与苦味值相关性，将16种半干型黄酒样品分别按照表5中挥发性成分、氨基酸及理化指标（X1～X30）进行PLSR模型验证，并得到黄酒苦味值（Y）预测模型的回归方程如下：Y=0.037 3X1+0.033 0X2+0.110 4X3-0.000 2X4+0.121 6X5+0.1565X6+0.1477X7+0.0717X8+0.0602X9+0.1499X10-0.0345X11-0.0133X12-0.0185X13-0.0976X14-0.0091X15+0.0603X16-0.0434X17-0.0336X18+0.0401X19-0.0202X20+0.0472X21-0.0189X22-0.0343X23+0.0202X24+0.0239X25+0.0078X26-0.0034X27-0.0105X28+0.1023X29-0.138 5X30-0.032 2。此定量模型的自变量拟合度（RX2）为0.62，因变量拟合度（RY2）为0.883，预测拟合精度（Q2cum）=0.783＞0.6，说明该模型拟合效果好且预测结果能够被接受。将另外从市场购买的不同价位具有代表性的黄酒样品HJ17、HJ18、HJ19、HJ20使用模型进行验证，得到预测苦味值和评定苦味值分别见表5。由表5可知，样品HJ17模型预测苦味值为32.0，评定苦味值30，偏差率6.6%；样品HJ18模型预测苦味值为21.5，评定苦味值24，偏差率10.3%；样品HJ19模型预测苦味值为28.0，评定苦味值30，偏差率6.6%；样品HJ20模型预测苦味值为27.5，评定苦味值26，偏差率5.8%，最大偏差率接近10%。结果表明，黄酒苦味值预测模型的预测值准确，能达到黄酒苦味值感官评定准确率的90%。

表5 以挥发性成分、氨基酸及理化指标预测黄酒样品苦味值模型验证Table 5 Model validation of predicting bitterness value of Huangjiu samples with volatile components,amino acids and physicochemical indexes

续表

3 结论

本试验研究了黄酒样品中挥发性成分、氨基酸及理化指标与其苦味的关系，Pearson相关性分析结果表明，黄酒的苦味值与挥发性物质如酒精、异戊醇、异丁醇、正丙醇和乳酸乙酯等相关性较高（R=0.623～0.808），与苦味氨基酸如脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸等相关性低（R=0.246～0.464），与部分氨基酸为负相关，特别是甘氨酸（R=-0.536）呈显著负相关，酒精与苦味相关性最高（R=0.850）、总酸对苦味有促进作用（R=0.649），总糖对苦味有明显抑制作用（R=-0.735）。PLSR模型验证了苦味值与挥发性成分、氨基酸及理化指标的关系，不同苦味值的黄酒可以明显地被模型区分开，黄酒苦味值预测模型的预测值准确，达到黄酒苦味值感官评定准确率的90%。研究结果表明黄酒苦味值可以通过仪器测定黄酒挥发性成分、氨基酸及理化指标直接确定，这为黄酒苦味值的判定提供了一种客观有效的技术方法。