一测多评法测定双黄连注射液中4 种成份的含量

王奎鹏，徐兴敏，方清朝，王均伟，王祖红

1 河南中医药大学第一附属医院，郑州 450000；

2 河南科技大学法医学院，洛阳 471000；3 河南福森药业有限公司，南阳 474450

双黄连注射液由金银花、黄芩和连翘按1∶1∶2的比例配伍，并经过提取精制而成。其具有清热解毒、清宣风热之功效，可治疗外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛，也适用于病毒及细菌感染所致的上呼吸道感染、肺炎、扁桃体炎、咽炎等，收载于原《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第18册［1］。现行国家药品标准WS3-B-2104-96-2010通过测定绿原酸、咖啡酸、黄芩苷和连翘苷4 个成份的含量，对双黄连注射液进行质量评价。目前双黄连注射液的含量测定均采用外标法（external standard method，EMS），即在相同的色谱条件下，以待测组份的纯品为对照，比较对照品和样品中待测组份的响应信号进行定量［2-6］。中药成份复杂，仅检测单一药效成份无法作出客观全面的评价，而多组份同时测定要求具备多个对照品，部分中药对照品不易购置或制备，影响了中药质量评价的研究进程［7］。一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）基于多指标质量控制的研究思路，解决了参比物质价格高或制备困难等难题，可实现同时检测多指标成份，已成为中药及其制剂质量评价的新模式［8］。当前国内外尚无采用QAMS 测定双黄连注射液成份含量的报道。基于此，本实验以连翘苷为内标参照物，计算绿原酸、咖啡酸、黄芩苷的相对校正因子（fs/i），并测定各成份含量。采用EMS 同步测定，验证QAMS 的准确性和可行性，为评价双黄连注射液的质量提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪［包括四元泵、VWD 检测器、ChemStation 化学工作站，安捷伦科技（中国）科技有限公司］；BP211D 电子分析天平（德国赛多利斯公司）；YMC-C18 色谱柱（150mm×4.6mm，5μm，日本YMC 公司）；KQ-700VDE 型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；YB-Z 型真空恒温干燥箱（天津药典标准仪器厂）。

1.2 试药

绿原酸（批号：110753-201817，纯度96.8%）、咖啡酸（批号：110885-201703，纯度99.7%）、黄芩苷（批号：110715-201821，纯度95.4%）、连翘苷（批号：110821-201816，纯度95.1%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，美国霍尼韦尔公司）；甲酸（色谱纯，中国医药集团有限公司）；超纯水（河南福森药业有限公司）；双黄连注射液（河南福森药业有限公司，批号：202009061、202009071、202009081、202009091、202009101）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采 用YMC-C18 色 谱 柱（150mm×4.6mm，5μm）；以乙腈-0.2%甲酸为流动相进行梯度洗脱（见表1），程序结束后运行5min；检测波长为324nm（绿原酸、咖啡酸）和280nm（黄芩苷、连翘苷）；柱温为35 ℃；进样量10μl；流速为1.0ml/min。理论板数按连翘苷峰计算应不低于6000，绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、连翘苷与相邻色谱峰的分离度应达到1.5 以上。

表1 洗脱梯度程序

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备

精密称取绿原酸、咖啡酸、黄芩苷和连翘苷对照品适量，置棕色量瓶中，加 50%甲醇制成质量浓度分别为40、30、60、60μg/ml 的混合对照品溶液，室温保存，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密移取供试品2ml，置50ml 棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。

2.2.3 阴性对照品溶液的制备

按双黄连注射液的生产工艺，制备无黄芩、金银花、连翘的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

按“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。

图1 混合对照品（A）、阴性对照品（B）和样品（C）的高效液相色谱（HPLC）图

2.3.1 线性关系

分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液1、3、5、10、15、20、30、50、80、100μl，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，详见表2。结果表明，各成份在各自范围内的线性关系均良好。

表2 4 种成份线性关系

2.3.2 精密度试验

取同一供试品（批号：202009101），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，连续进样 6 次，测得绿原酸、咖啡酸、黄芩苷和连翘苷的峰面积RSD 分别为0.18%、0.43%、0.18%、1.67%，表明仪器精密度良好。详见表3。

表3 4 种成份精密度试验结果

2.3.3 重复性试验

取同一供试品（批号：202009101）6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录各色谱峰峰面积。绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、连翘苷的平均含量分别为0.195、0.065、7.108、0.143 mg/ml，RSD 分别为0.21%、0.63%、0.21%、0.86%，表明该方法重复性良好。详见表4。

表4 4 种成份重复性试验结果

2.3.4 稳定性试验

取同一供试品（批号：202009101），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8h进样测定，测得绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、连翘苷的RSD 分别为0.11%、0.29%、0.04%、1.42%，表明供试品溶液在8h 内稳定性良好。详见表5。

表5 4 种成份的稳定性试验结果

2.3.5 加样回收率试验

分别精密吸取含量已知的样品溶液（批号：202009101）2.0ml，共6 份，分别加入各对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定含量，计算加样回收率和RSD。绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、连翘苷的平均加样回收率分别为100.97%、100.08%、94.49%、101.10%，RSD 分别为0.26%、0.25%、0.32%、0.45%，表明测定结果准确。详见表6。

表6 4 种成份的加样回收率试验

2.4 相对校正因子（fs/i）的建立及耐用性评价

2.4.1 相对校正因子（fs/i）的建立

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液1、3、5、10、15μl，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录各对照品中各组份的峰面积。以连翘苷为内标参照物，根据公式fs/i=（Wi×As）/（Ws×Ai），分别计算绿原酸、咖啡酸、黄芩苷的相对校正因子。式中，fs/i为相对校正因子；Ws为内标参照物的质量（μg）；As为内标参照物的峰面积；Wi为待测成份的质量（μg）；Ai为待测成份的峰面积。详见表7。

表7 样品中待测成份的相对校正因子

2.4.2 相对校正因子（fs/i）的耐用性评价

考察不同高效液相色谱仪（Agilent 1260、赛默飞 DGP-3600SDN 和Waters E2489）对待测成份相对校正因子（fs/i）的影响。结果绿原酸、咖啡酸、黄芩苷的相对校正因子（fs/i）RSD 分别为 0.79%、0.76%、0.70%，表明不同色谱仪对3 种成份的相对校正因子（fs/i）无显著影响。

考察不同型号色谱柱［Agilent Zorbax SBC18（150mm×4.6mm，5μm）、Syncronis C18（150mm×4.6mm，5μm）、YMC-C18（150mm×4.6mm，5μm）］对待测成份相对校正因子（fs/i）的影响。结果绿原酸、咖啡酸、黄芩苷的相对校正因子（fs/i）RSD 分别为1.20%、1.90%、1.50%，表明不同色谱柱对3 种成份的相对校正因子（fs/i）无显著影响。

2.5 连翘苷对照品溶液的稳定性试验

取连翘苷（批号：110821-201816，纯度95.1%）对照品溶液，分 别于0、1、2、3、4、5、6、7个月进样测定，测定连翘苷对照品的含量分别为99.98%、100.43%、101.58%、99.97%、98.96%、100.38%、100.30%、99.68%，RSD 为0.09%， 表明连翘苷对照品溶液在7 个月内稳定性良好。

2.6 样品含量测定

精密吸取 5 个批次的双黄连注射液供试品溶液各10μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定。采用EMS［9］和QAMS 分别计算供试品中各待测成份的含量，详见表8。EMS 和QAMS 所计算出的结果无统计学差异（P＞0.05），表明QAMS 可用于双黄连注射液中绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、连翘苷的定量分析。

表8 4 种成份的含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择

依据2020 年版《中国药典》和紫外扫描测定结果可知，黄芩苷、连翘苷、绿原酸、咖啡酸分别在274、280、324、323nm 处有最大吸收，在同一波长处同时测定4 种成份具有难度。由于连翘苷的含量较低，且在324nm 处基本无吸收，因此确定连翘苷与黄芩苷的检测波长为 280nm，并在检测时增加进样量［5］；绿原酸类化合物和咖啡酸均含有咖啡酰结构，在 324nm 处有最大吸收，故设定绿原酸和咖啡酸的检测波长为324nm［6］。综合考虑各峰高及峰面积的比例，选择324nm 和280nm 为最终检测波长，在线进行波长切换检测。

3.2 流动相和洗脱梯度的选择

试验中考察了乙腈-0.07%甲酸溶液［3］、0.6%冰醋酸水溶液-乙腈［10］、乙腈-0.2%甲酸［11］等不同流动相以不同比例进行成份洗脱，最终以乙腈-0.2%甲酸为流动相进行梯度洗脱。该条件下样品分析时间短（40min 内即完成一针进样检测），柱效高，色谱图基线平稳，峰形对称，对照品出峰时间适中，主峰与其他峰的分离度、主峰的理论板数等色谱参数均符合2020 年版《中国药典》的要求。

3.3 内标参照物的选择

连翘苷不耐高温，50℃以上会破坏连翘苷的结构使其变性，但在室温条件下稳定性良好；溶液的酸碱度对连翘苷稳定性影响显著，pH 为7 时最稳定；连翘苷的光稳定性好［12］。本试验在7 个月内连续8次测定同批号的连翘苷对照品，结果表明其稳定性良好。

综上，2015 年版《中国药典》将QAMS 用于中药提取物及中药制剂的多指标质量控制。近年来在中药材、中药饮片及中药制剂的质量控制中，QAMS 的应用范围已由同类成份的测定扩展至多类成份的测定［13］。本研究结果表明，QAMS 具有简便可行、准确、快速、重现性好、专属性强的特点，可有效降低质控成本、提高质控效率，可用于双黄连注射液的质量评价。