微波催陈对黑米酒中酚类、有机酸类和酯类含量的影响

汤林月 原江锋,2,3 赖钰婷 龚明贵,2,3 孙建瑞,2,3

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2. 河南科技大学食品与生物工程学院微生物资源开发与利用重点实验室，河南 洛阳 471023；3. 河南省食品微生物工程技术研究中心，河南 洛阳 471023)

黑米酒是以黑米为主要原料，糯米、黑豆等为辅料，甜酒曲和黄酒曲为发酵剂，经灰霉菌和酵母菌发酵得到的低度饮料酒[1]。黑米酒富含多种营养成分，如维生素、氨基酸、微量元素、酚类、有机酸类、酯类化合物等[2]，且具有较强的抗氧化、抗炎症、延缓衰老、调节生理节律、预防心脑血管疾病等保健功能[3]。

与其他酒类一样，新酿的黑米酒需要陈化过程，在此过程中黑米酒的活性成分会发生一定变化，使其口感、风味和色泽进一步提升。传统陈酿技术耗时长、成本高，因而限制了黑米酒企业的发展。微波催陈是近几年发展起来的具有前景的催陈技术[4]，已被应用于黑米酒的催陈研究中[5]。目前，对于微波催陈的研究主要集中在微波条件下黑米酒中酚类、黄酮类、理化特性等指标的变化：Yuan等[6]用EPR研究微波诱导模型酒产生羟乙基自由基，从内在机制阐述了微波催陈的原理；王婷婷等[7]研究了微波对酒中模式蛋白氧化特性的影响；候增超等[8]研究了微波对小分子酚酸和大分子化合物相互作用的影响；陈卓瑶等[4]研究了微波技术对黑米酒中主要活性成分、物化特性和活性的影响。

酚类物质的组成和含量不仅影响黑米酒的颜色、香气和口感等感官特性，还影响黑米酒的生理活性[9]。黑米酒的酸性特性主要由有机酸的种类、浓度及组成决定，进而影响黑米酒的口感[10]。黑米酒的香气主要由酯类物质的浓度和组成来衡量，与黑米酒的品质密切相关[3]。研究拟以黑米酒为研究对象，探究不同微波处理条件对黑米酒中主要酚类、有机酸类和酯类含量的影响，为将微波技术应用于黑米酒并改善黑米酒感官品质提供理论依据，以期解决黑米酒传统陈酿技术存在的耗时长、成本高等弊端。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑米酒：酿造年份为2019年，酒精含量为9%(体积分数)，陕西朱鹮黑米酒业有限公司；

没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸和丁香酸：色谱纯(≥98.00%)，合肥博美生物科技有限责任公司；

乙酸、酒石酸、草酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸：分析纯，中国食品药品检定研究院；

乙酸乙酯、戊酸乙酯、乳酸乙酯：分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司；

Folin-Ciocalteu试剂、碳酸钠、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸、甲酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯(≥98.00%)，美国默克公司。

1.2 仪器设备

NewClassic电子天平：ME104E型，上海梅特勒—托利多仪器有限公司；

紫外—可见分光光度计：UV1800PC型，上海菁华科技仪器有限公司；

高效液相色谱：1260型，安捷伦科技有限公司；

微波合成仪：XH-MC-1型，北京祥鹄科技发展有限公司；

大扭矩调速型蠕动泵：WT600S型，保定雷弗流体科技有限公司；

低温冷却液循环泵：DLSB-10L型，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品微波处理过程 采用实验空自建的闭合式磁力搅拌控温冷却系统(CMCC-MI)[11]，将样品(50 mL)置于CMCC-MI系统样品瓶中，于不同微波条件下处理样品，每组重复3次。处理条件：设定微波温度40 ℃、时间3 min，在功率为100，200，300 W条件下处理；设定微波时间3 min、功率100 W，在微波温度为30，40，50 ℃条件下处理；设定微波功率100 W、温度40 ℃，在微波时间为1，3，6 min条件下处理。

1.3.2 酚类物质含量测定

(1) 总酚含量测定：Folin-酚比色法[12]。

(2) 流动相的制备：流动相A为1%甲酸的水溶液，流动相B为1%甲酸的甲醇溶液，经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气20 min后使用。

(3) 酚类标准溶液的配制：精密称取原儿茶酸(2.5 mg)、没食子酸(25.0 mg)、丁香酸(5.4 mg)、咖啡酸(2.6 mg)，用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，得原儿茶酸、没食子酸、丁香酸、咖啡酸的质量浓度分别为0.050，0.500，0.108，0.052 mg/mL的混合标准品溶液Ⅰ。

(4) 色谱条件：色谱柱为反相液相色谱柱(安捷伦ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温25 ℃，进样量20 μL，流速1.0 mL/min；检测波长280 nm，梯度洗脱条件： 0 min，100% A；3 min，98% A+2% B；18 min，90% A+10% B；28 min，80% A+20% B；43 min，70% A+30% B；63 min，30% A+70% B；64 min，0% A；69 min，0% A；74 min，98% A+2% B。

1.3.3 有机酸类含量测定

(1) 总酸含量测定:采用酸碱滴定法[13]，以酒石酸为当量，计算总酸含量。

(2) 流动相的制备：用H3PO4溶液将0.02 mol/L的NaH2PO4溶液的pH调至2.70，滤膜过滤并超声脱气后使用。

(3) 有机酸类标准溶液的配制：精密称取乙酸(0.88 mL)、酒石酸(40.0 mg)、柠檬酸(60.0 mg)、乳酸(0.16 mL)、草酸(1.2 mg)、苹果酸(50.0 mg)标准品后混合，用0.02 mol/L的NaH2PO4(pH 2.70)定容至20 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得乙酸(46.2 mg/mL)、酒石酸(2.0 mg/mL)、柠檬酸(3.0 mg/mL)、乳酸(9.6 mg/mL)、草酸(0.06 mg/mL)、苹果酸(2.5 mg/mL)的混合标准品溶液Ⅱ。

(4) 色谱条件：色谱柱(TSKgel ODS-100V，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相0.02 mol/L NaH2PO4，柱温40 ℃，进样量10 μL，流速0.6 mL/min，检测波长220 nm。

1.3.4 酯类物质含量测定

(1) 总酯含量测定：采用酸碱滴定法[14]，以乙酸乙酯为当量，计算总酯含量。

(2) 流动相的制备：精确称取6.80 g KH2PO4，用纯净水溶解并定容至1 L，得0.05 mol/L KH2PO4的流动相A；乙腈为流动相B，滤膜过滤并超声脱气后使用。

(3) 酯类标准溶液的配制：在25 ℃条件下分别量取戊酸乙酯(ρ=0.875 g/mL)，乳酸乙酯(ρ=1.031 g/mL)和乙酸乙酯(ρ=0.902 g/mL)标准品0.229，0.485，0.554 mL，用乙腈定容至10 mL，所得质量浓度分别为20，50，50 mg/mL的混合标准品溶液Ⅲ，避光置于4 ℃备用。

(4) 色谱条件：色谱柱为反相液相色谱柱(安捷伦ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.05 mol/L KH2PO4溶液；柱温30 ℃；进样量20 μL；流速1.0 mL/min；检测器波长210 nm，采用等度洗脱程序(VKH2PO4∶V乙腈=92∶8)。

1.3.5 标准曲线的绘制 精密吸取0.10，0.20，0.50，1.00，2.50，5.00 mL的混合标准品溶液Ⅰ于容量瓶，用甲醇定容至10 mL；精密吸取0.20，0.40，0.50，1.60，3.20 mL的混合标准品溶液Ⅱ于容量瓶，用0.02 mol/L的NaH2PO4溶液定容至20 mL；精密吸取0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 mL的混合标准品溶液Ⅲ于容量瓶，用0.05 mol/L 的NaH2PO4溶液定容至20 mL。上述溶液分别按相应的色谱条件检测，以样品的质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，得到黑米酒中主要活性成分的标准曲线方程、相关系数和线性范围(见表1)，R2>0.99，说明黑米酒中的主要酚类、有机酸类和酯类化合物在相应的质量浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

表1 13种标准品的标准曲线、相关系数、线性范围Table 1 Standard curve, correlation coefficient, linear range of 13 kinds of standards

1.4 数据处理

以上所有试验均重复进行3次，使用SPSS 24.0对试验数据进行方差分析，P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表示具有极显著性差异，使用Origin 2018软件进行相关图表绘制。

2 结果与分析

2.1 微波处理对黑米酒酚类物质的影响

黑米酒中总酚标准曲线回归方程为Y=13.92X-1.74，R2=0.992 6。不同微波处理条件对黑米酒中酚类物质含量的影响如图1所示，黑米酒中含有较高浓度的酚类，其中原儿茶酸含量最高；经过不同微波条件处理的黑米酒，总酚和咖啡酸含量呈下降趋势，原儿茶酸、没食子酸和丁香酸含量呈上升趋势。酚类物质是黑米酒的骨架物质，参与形成浓郁的陈酿香气，可以提高酒体的结构感、抗氧化性和抗自由基能力等，但过多的酚类物质会使黑米酒的苦涩味加重，严重影响黑米酒的色泽和感官质量[15]。由图1可知，随着微波功率、温度和时间的增加，微波处理后黑米酒中总酚含量与未处理的相比显著下降(P<0.05)。总酚含量下降的原因可能是酒体中的介质在微波场下相互摩擦，诱导产生大量自由基[7]，导致酚类物质发生氧化或降解反应[11]，进而导致总酚含量下降，这与自然陈酿过程中总酚含量变化趋势一致[16-17]。

*与对照组相比差异显著(P<0.05)，**与对照组相比差异极显著(P<0.01)图1 微波处理条件对黑米酒中酚类物质含量的影响Figure 1 Effects of microwave treatment conditions on the content of phenols in black rice wine

原儿茶酸是涩味与苦味的主要来源，其含量影响酒的滋味和口感[18]。由图1可知，黑米酒经较高功率和较长时间微波处理后原儿茶酸含量明显增加(P<0.05)，由于原儿茶酸是合成某些复杂类分子如花青素的前体，在较高功率和较长时间条件处理下可能加速了这些大分子的解聚反应，导致原儿茶酸含量有所增高，从而改变了黑米酒的口感。

没食子酸与黑米酒的品质和口感密切相关[19]，其浓度、聚合度及化学结构影响酒的涩味和苦味。由图1可知，在300 W、40 ℃和3 min的微波条件下没食子酸含量明显增加(P<0.01)，说明在此微波处理条件下能达到较好的催陈效果，对黑米酒的口感起到关键作用。

黑米酒中含有多种抗氧化、消除自由基的花色苷单体，丁香酸作为辅色素可与花色苷单体结合产生辅色效应，使酒色度更深、色泽更稳定[20]。由图1可知，与未处理的黑米酒相比，经微波处理的丁香酸含量显著增加(P<0.05)，可能是因为微波场下的丁香酸花色苷聚合物发生部分降解，从而提高了黑米酒中丁香酸的含量；随着温度和时间的逐渐增加，丁香酸含量趋于稳定，说明丁香酸花色苷聚合物的降解速度和聚合速度基本一致。

咖啡酸是黑米酒中重要的酚类辅色素，可使花色苷聚合成稳定的化合物，提高花色苷的稳定性，从而影响黑米酒的色泽[21]。与未处理的黑米酒相比，经微波处理后黑米酒中咖啡酸含量呈明显下降趋势(P<0.05)，可能是因为咖啡酸与花色苷结合产生花色苷衍生物，从而提高花色苷的稳定性；随着微波功率、温度、时间的升高，咖啡酸的质量浓度逐渐趋于稳定，可能是因为咖啡酸的生成反应和咖啡酸的消耗反应处于动态平衡。由于咖啡酸辅色效果较好，在不同微波条件下咖啡酸含量的降低可以间接反映黑米酒的颜色趋于稳定，从而说明微波技术有催陈黑米酒的作用。

2.2 微波处理对黑米酒有机酸类物质的影响

有机酸是形成酒复合风味的主要成分，赋予酒体丰满度和酸爽感，与其他风味物质共同组成酒所特有的芳香，是酒体醇厚、优雅等风味形成的关键[22]。有机酸含量较少时酒味寡淡，可以使黑米酒变得舒适可口，若有机酸含量过高，酒味变得厚重粗糙，对喉部产生强烈的刺激性，因此有机酸的含量是评价酒体风味的重要指标之一[23]。微波处理后黑米酒中的总酸含量略低于未处理黑米酒总酸含量，可能是由于微波处理加快了黑米酒中的分子运动，黑米酒中某些挥发性有机酸挥发导致总酸浓度降低；也可能是黑米酒吸收微波能后，分子内能增加，加速了酒体中的酯化反应，在一定程度上加速了黑米酒的熟化。从总酸含量变化来看，在功率100 W、温度30 ℃和较长时间微波处理条件下，总酸含量明显降低(P<0.05)，因此，采用低功率、低温和较长时间处理有利于黑米酒有机酸含量的控制。由图2可知，经微波处理后，黑米酒乙酸含量微弱上升；酒石酸、柠檬酸、乳酸和总酸含量呈下降趋势；草酸、苹果酸含量变化较小。

*与对照组相比差异显著(P<0.05)，**与对照组相比差异极显著(P<0.01)图2 微波处理条件对黑米酒中有机酸类物质含量的影响Figure 2 Effects of microwave treatment conditions on the content of organic acids in black rice wine

从乙酸含量变化可以看出(图2)，微波处理组中乙酸含量高于未处理组的，可能是由于微波能够诱导产生更多的自由基[6]加速了黑米酒中醇、醛、酸、酯之间的转化，导致黑米酒乙酸含量升高。

酒石酸含量在100 W、30 ℃、3 min或者6 min微波条件下明显降低(P<0.05)，可能是因为吸收了微波能后的黑米酒，分子内能增加，导致较多酒石酸发生降解或以酒石酸盐结晶析出。

在40 ℃或50 ℃下微波处理3 min或6 min后，柠檬酸的含量降低可能是由于微波场使黑米酒分子内能增加，加速了柠檬酸的脱羧和酯化反应；较高功率的微波场诱导产生更多的自由基[6]，可能造成柠檬酸的分解速度大于合成速度。黑米酒经6 min微波处理后柠檬酸含量极明显降低(P<0.01)，说明长时间微波处理可以减少柠檬酸带来的酸涩感，这与自然陈酿过程中柠檬酸的变化趋势一致。

在50 ℃时乳酸含量显著降低(P<0.05)，可能是由于较高温度的微波处理诱导黑米酒产生更多的自由基加速了乳酸的酯化反应，导致乳酸含量明显降低，因此100 W、3 min、50 ℃微波条件有利于保持黑米酒的醇厚感。

微波处理后的黑米酒中草酸含量变化不明显。随着微波时间和温度的增加苹果酸含量呈现出先降低后增加的波动，而微波功率的变化对苹果酸含量影响较小。苹果酸对黑米酒的酸味、稳定性和品质等方面有着很大影响，在陈酿过程中部分苹果酸转化成琥珀酸造成苹果酸含量下降[24]。在100 W、40 ℃、短时间的微波处理条件下，苹果酸的含量最低，此条件符合苹果酸在陈酿过程中的含量变化趋势。

2.3 微波处理对黑米酒酯类物质的影响

在自然陈酿过程中，随着酒体贮藏时间的延长，总酯含量呈上升趋势[25]。由图3可知，与未经处理的黑米酒相比，微波处理后的黑米酒中总酯含量增加，并且随着微波功率、温度和时间的增加而逐步增加，可能是由于微波通过高频电磁场使黑米酒中的极性分子和水高频极化，使独立的难溶分子基团有机融合、相互渗透，加快了酒中化学反应[26]。因此，微波处理可以增加黑米酒的香气，使酒体更加浓郁。

*与对照组相比差异显著(P<0.05)，**与对照组相比差异极显著(P<0.01)图3 微波处理条件对黑米酒中酯类物质含量的影响Figure 3 Effects of microwave treatment conditions on the content of esters in black rice wine

黑米酒中酯类化合物能够丰富黑米酒香气，提高酒体品质。由图3可知，经过微波处理后的黑米酒中戊酸乙酯、乙酸乙酯和总酯含量呈上升趋势，乳酸乙酯含量呈下降趋势。

经微波处理后的黑米酒中的戊酸乙酯含量与未处理的相比极显著增加(P<0.01)，说明微波处理可以加速戊酸乙酯的形成，有利于增加黑米酒的香气。

随着微波时间的延长，乙酸乙酯的含量极显著增加(P<0.01)，可能是因为微波处理加速了乙酸与乙醇的酯化反应；低功率微波有利于乙酸乙酯的含量升高；随着微波温度的增加，乙酸乙酯含量逐渐上升，在40 ℃时乙酸乙酯含量升高至65.55%，但在50 ℃时乙酸乙酯含量低于40 ℃时的，可能是由于较高的温度条件下降解作用大于合成作用，因此造成了乙酸乙酯的含量降低。工业生产过程中采用40 ℃、短时间和低功率的微波条件来促进乙酸乙酯的形成，该条件也能够更好地改善黑米酒的感官特性、促进黑米酒的陈化。

微波处理时间和功率对乳酸乙酯含量的影响较小；乳酸乙酯的含量在不同的微波温度条件下均低于未处理的，可能在处理过程中微波能量被黑米酒吸收，加速了黑米酒的乳酸乙酯的分解，当微波温度为30 ℃时，乳酸乙酯含量降低了35.65%。微波温度为40 ℃时，乳酸乙酯略微升高。因此，采用微波温度40 ℃、微波功率200 W有利于乳酸乙酯的形成。

3 结论

微波技术可以通过加速黑米酒活性成分的分解、氧化、聚合、酯化等反应快速改变黑米酒中酚类、有机酸、酯类物质以及相应的13个单体化合物的含量，从而快速改变黑米酒的感官品质。为了进一步科学调控黑米酒催陈工艺后续需要对黑米酒理化特性的改变进行研究。