罗勒和紫苏挥发油的化学组分及其抑菌活性分析

智亚楠，赵筱岑，常卫格，王霄阳，李甜甜，陈利军

(信阳农林学院 农学院，河南 信阳464000)

使用化学农药防治植物病害是目前植物生产中的常用手段，然而化学农药对环境和人类的生活造成了一定的困扰，最突出的问题就是农药残留和植物病原菌产生抗药性。因此，寻找安全、绿色的新型杀菌剂显得尤为重要。植物挥发油是植物的重要次生代谢产物，具有分子量较小、易挥发的特点，因其独特的生物活性，在植物保护、食品保鲜、饲料添加、医学等领域受到广泛关注[1]。

近年来，不断有人研究发现各种植物挥发油的抑菌作用，植物挥发油作为一类新型的杀菌剂，具有广阔的应用前景。例如山苍子油对油茶炭疽病菌、西瓜枯萎病菌和水稻稻瘟病菌的生长均有抑制作用[2]。肉桂挥发油具有较强的抗菌活性，不但可以有效抑制沙门氏菌、黄色葡萄球菌等多种病原性微生物，而且对食品储藏过程中霉腐微生物的生长起到抑制作用，从而达到防腐保鲜的目的[3]。

罗勒(Ocimumbasilicum)和紫苏(Perillafrutescens)是唇形科中常见的芳香植物材料，含有丰富的挥发油。在活性方面，有研究者发现罗勒挥发油对茶树的小贯小绿叶蝉有抑制趋避效果；对绣线菊蚜、甜菜蚜、谷斑皮蠹、赤拟谷盗和无花果粉蚧也有杀虫活性[4-5]。另外，罗勒挥发油对小茴香根腐病菌具有良好的抑制作用[6]，对樱桃番茄的贮藏保鲜也有一定的作用[7]。紫苏叶挥发油具有良好的药用价值，有抗氧化、抗炎、抗菌和增强免疫力的作用，可作为保健品调理人体机能，作为抗衰老成分用于护肤品中[8]。另外紫苏挥发油能明显地抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌三类细菌的活性，在食品保鲜上也有良好的应用价值[9]。但这2种挥发油在植物病原菌控制上研究较少。

本试验采用水蒸气蒸馏法分别提取罗勒和紫苏植株的挥发油，结合气相色谱-质谱联用法(GC-MS)分析挥发油的化学组分，并以番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌和半夏白绢病菌4种植物病原真菌为供试菌，测定2种挥发油的熏蒸抑菌活性。从而为罗勒和紫苏挥发油在植物杀菌剂发面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

罗勒和紫苏：罗勒于超市采购；紫苏采集于信阳农林学院周围田地，选取健康植株，剪成3 cm左右的小段。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：去皮马铃薯、葡萄糖、琼脂、水。

植物病原真菌：番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)和花生白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)，由信阳农林学院农学院植物病理实验室分离保存。

主要仪器与设备：Agilent 6850/5975气质联用仪(美国安捷伦公司)、NIST14谱库、HP-250S生化培养箱、KDM-2000电热套(金坛市恒丰仪器制造有限公司)、立式高压蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)等。

1.2 挥发油的提取

罗勒和紫苏挥发油的提取采用水蒸气蒸馏法[10]。在5000 mL的圆底烧瓶中加入一定量的蒸馏水，称取植株小段500 g，装入圆底烧瓶中，浸泡3 h，连续蒸馏提取4 h至油量不再增加。静置分层后读取挥发油体积，并分离油水混合物，收集挥发油，得到具有特殊浓郁气味的油状液体，保存于4℃冰箱备用。

1.3 挥发油GC-MS分析条件

分析条件参考陈利军[11]等测定挥发油的条件。色谱条件：色谱柱为HP-5ms毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温，初始柱温为60℃，保持2 min，以10℃/min升温速率升至230℃，保持1 min；载气为高纯氦气，流速为1.0 mL/min；进样前挥发油用乙醚稀释，进样量为1.0 μL，不分流。质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，扫描范围33～350 amu。

1.4 挥发油熏蒸抑制作用测定

采用菌丝生长速率法，在培养皿内熏蒸处理测定挥发油对植物病原菌的抑制作用[11]。将直径为7 mm的圆形滤纸片，干热灭菌后备用。在直径90 mm的培养皿中制成厚薄均匀的PDA平板。取培养3 d的植物病原菌平板，在菌落边缘打取直径为5 mm菌饼，接种在平板中央。然后在皿盖上对应放置已灭菌的圆形滤纸片，在滤纸片上分别滴加罗勒和紫苏挥发油。皿底皿盖对扣后，用封口膜密封，于25℃恒温培养箱中倒置培养。以滤纸片上不滴加挥发油为对照，重复3次。72 h后用十字交叉法测量菌落直径，计算挥发油对植物病原真菌的抑菌率。

菌落生长抑制率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落生长直径]×100%。

1.5 数据分析

利用SPSS22.0计算有效中浓度(EC50)及其置信区间，并根据EC50值比较挥发性油对不同植物病原真菌的抑制作用。

2 结果与分析

2.1 罗勒和紫苏挥发油组分GC-MS分析

利用气质联用仪(GC-MS)对罗勒和紫苏挥发油组分进行分析，总离子流量图分别如图1和图2所示。利用色谱峰面积归一法测得各组分的相对含量，所得质谱图经NIST05质谱数据库检索；与标准图谱核对，并结合化学物质登录号(CAS号)分析，罗勒和紫苏挥发油组分如表1和表2所示。

图1 罗勒挥发油的GC-MS总离子流图 图2 紫苏挥发油的GC-MS总离子流图

从表1可看出，从罗勒挥发油中分离到19种组分，鉴定了17个，占总组分的94.723%。罗勒挥发油中相对含量较高的组分分别为芳樟醇(33.749%)，其次为乙基异丙醚(22.033%)和桉树脑(6.893%)等。从表2可看出，从紫苏挥发油中共分离到8个组分，鉴定出了其中的6个组分，占挥发油总量的97.7%。其中相对含量最高的组分分别为2-丁酰呋喃(79.093%)和2-呋喃甲酰乙腈(12.398%)。

表1 罗勒挥发油化学组分分析结果

表2 紫苏挥发油化学组分分析结果

2.2 罗勒和紫苏挥发油对植物病原真菌的熏蒸抑制作用

罗勒挥发油对4种供试的植物病原真菌均具有良好带的熏蒸抑制作用，随着挥发性油剂量的增加而抑制作用增强。在4.0 μL/皿时，罗勒挥发油对供试病原菌的抑菌率均达到50%以上，在6.0 μL/皿时对花生白绢病菌的抑制率达到85.57%(图3，表3)。

注：第一排左起浓度依次为0、0.5、1.0 μL/皿；第二排左起依次为2.0、4.0、6.0 μL/皿

表3 罗勒挥发油对植物病原真菌菌丝生长的熏蒸抑制作用

紫苏挥发油同样对4种供试的植物病原真菌具有良好带的熏蒸抑制作用。当剂量为1.0 μL/皿时，紫苏挥发油对花生白绢病菌和番茄灰霉病菌的抑制率均达到50%及以上，2.0 μL/皿时，对莴苣菌核病菌的抑菌率达到51.30%，当剂量为6.0 μL/皿时对4种供试病原菌的抑制率在67.96%～97.81%(图4、表4)。

注：第一排左起浓度依次为0、0.5、1.0 μL/皿；第二排左起依次为2.0、4.0、6.0 μL/皿

表4 紫苏挥发油对植物病原真菌菌丝生长的熏蒸抑制作用

表5为罗勒挥发油对4种植物病原真菌菌丝生长的毒力测定结果。可以看出，罗勒挥发油对花生白绢病菌的抑制作用最强，EC50仅为1.50 μL/皿，对小麦赤霉病菌的抑制作用相对较弱，EC50为3.40 μL/皿。

表5 罗勒挥发油对植物病原真菌菌丝生长的毒力测定结果

紫苏挥发油对番茄灰霉病菌的抑制作用最强，EC50为0.64 μL/皿，对花生白绢病菌的作用次之，EC50为0.99 μL/皿。对油菜菌核病菌和小麦赤霉病菌的EC50分别为为1.44 μL/皿和2.48 μL/皿(表6)。除小麦赤霉病菌外，紫苏挥发油对另外3种病原菌的毒力均比罗勒挥发油强。

表6 紫苏挥发油对植物病原真菌菌丝生长的毒力测定结果

3 结论与讨论

本试验采用水蒸气蒸馏法分别提取了唇形科植物罗勒和紫苏的挥发油，利用GC-MS分析鉴定发现，罗勒挥发油主要组分为芳樟醇(33.749%)、乙基异丙醚(22.033%)和桉树脑(6.893%)等，这与Kostic等[12]人研究结果相似。而黄丽沄等[13]学者研究发现罗勒挥发油中丁香酚、酞酸二乙酯、草蒿脑和石竹烯含量相对较高。本试验中紫苏挥发油主要组分分别为2-丁酰呋喃(79.093%)和2-呋喃甲酰乙腈(12.398%)。姚正颖等[14]从江苏产紫苏干品中提取挥发油，发现2-丁酰呋喃含量高达72.32%，与本试验结果相似。而孟青等[15]采用GC-MS法对水蒸气蒸馏提取湖北产紫苏叶茎挥发油分析，发现挥发油的主要成分是紫苏醛、柠檬烯、反式-石竹烯等；郑梅琴等[16]发现江西产紫苏挥发油主要成分为洋芹醚；与本试验差异较大。这些差异可能是由于植物的产地、品种不同所造成的。

在本试验中通过熏蒸抑菌试验发现，罗勒和紫苏挥发油对番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌和花生白绢病菌均具有良好的熏蒸抑制作用。罗勒挥发油对4种供试菌的EC50为1.50～3.40 μL/皿，这种结果可能与罗勒挥发油中含有较多的芳樟醇有关。有学者研究发现，天然芳樟醇对于柑橘炭疽病菌、辣椒疫病菌、胡萝卜菌核病菌和柑橘褐色蒂腐病菌4种果蔬致病菌均有较强的抑菌效果[17]。而紫苏挥发油对4种供试菌的EC50为0.64～2.48 μL/皿。由于植物挥发油环境相容性好，具有潜力作为熏蒸型杀菌剂用于病害防控。但植物挥发油组分复杂，且组分受环境、品种等的影响，如何在生产上应用还需进一步探讨。