基于网络药理学和分子对接技术研究黄芪-川芎治疗脊髓损伤的作用机制Δ

漆国栋，漆 伟，刘才英，李姝君，江 琼#

(1.重庆市中医骨科医院骨科，重庆 400010； 2.重庆医科大学中医药防治代谢性疾病重庆市重点实验室，重庆 400016)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种具有较高致残率的中枢神经系统疾病，严重影响患者身心健康，在全球范围内皆具有流行性[1-2]。我国SCI的年患病率高于世界平均水平，达每百万人中37人次，且治疗经济负担重，单次治疗费用可高达30余万元[3]。现代医学主要采用多学科协同方案治疗SCI，包括急性期的神经减压外科治疗和亚急性及后期的综合康复治疗，但总体效果有限[4-5]。传统中医理论中虽无SCI的病名，但是历代典籍对该病的认识颇多，其中《灵枢·寒热病》中最早记载了相类似的“体惰”。现代中医多认为其病位在督脉，督脉阻滞，累及任冲及肝肾、脾胃等，多以活血祛瘀、通督为治疗原则[6-7]。黄芪功以益气固表，川芎为行气活血要药，两药配伍可共奏益气行气、活血化瘀之功效[8]。有研究通过中医传承辅助系统进行分析，结果表明，黄芪、川芎为SCI内治处方中选择频次居前列的药物[9-10]。补阳还五汤[11]、脊髓康[12]为治疗SCI的经典复方，其中黄芪、川芎皆为方中重要组成部分。课题组在前期实验研究中已初步明确了黄芪、川芎的主要成分在治疗SCI种的作用效果[13-15]。但两药配伍的整体作用靶点和机制尚不明确，鉴于此，本研究运用网络药理学和分子对接技术，探讨黄芪-川芎治疗SCI的作用机制。

1 资料与方法

1.1 黄芪-川芎的成分及靶点筛选

检索中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp2/)，以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为标准，筛选黄芪-川芎的成分及对应靶点，并通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)以物种为人的原则规范靶点名称。

1.2 SCI靶点纳入及共同靶点

利用GeneCard数据库(https://www.genecards.org/)检索SCI相关靶点，检索词为“spinal cord injury”，纳入标准为相关度≥10。在VENNY 2.1软件中分别导入药物靶点和疾病靶点的名称，绘制韦恩图，获得共同靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建分析

利用STRING 11.0数据库(https://string-db.org/)，研究物种设定为“Homo sapiens”，设定高等置信度为0.700，隐藏无关联的靶点，从而构建出PPI网络图。通过Network Analyzer功能进行网络拓扑分析，以节点度值大小进行PPI核心靶点统计。节点度值代表与该节点连线的条数，数值越大则表明其在网络中起到的枢纽作用越重要[16]。

1.4 基因本体(GO)功能富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

运用R 3.6.0软件和Bioconductor平台(https: //www.bioconductor.org/)对共同靶点以校正P<0.01为设定条件进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO功能富集分析包括生物学过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)。最终以条形图和气泡图形式呈现富集分析结果。

1.5 成分-靶点网络构建分析

将黄芪-川芎成分、成分靶点和共同靶点导入Cytoscape软件构建网络，并行网络拓扑分析，评价方法与PPI网络分析相同。

1.6 关键靶点分子对接

通过成分-靶点网络筛选出关键靶点及相应的活性成分，登录PDB数据库(http://www.rcsb.org/)筛选关键靶点的蛋白结构，在TCMSP数据库(https://tcmsp-e.com/tcmsp2/)中下载对应活性成分的分子结构。先利用PyMOL 2.5.0及 AutoDock软件处理蛋白和配体分子，然后通过Vina预测分子对接的结合能，最后进行分子对接可视化展示。

2 结果

2.1 黄芪-川芎成分及靶点

通过TCMSP数据库根据筛选标准共得到26个活性成分，其中黄芪的活性成分20个，川芎的活性成分7个，叶酸为两者的重复成分，见表1。通过Uniprot数据库规范靶点名称，得到药物活性成分对应的靶点97个。

表1 黄芪-川芎主要活性成分基本信息Tab 1 Main ingredients of astragalus membranaceus-ligusticum Chuanxiong

2.2 SCI靶点及共同靶点

在GeneCards数据库中获得符合筛选条件的疾病靶点690个。韦恩图中间交集为药物与疾病的共同靶点，共38个，见图1。

图1 药物与疾病靶点交集韦恩图Fig 1 Venn diagram of intersection of drugs and disease targets

2.3 PPI网络的构建与分析

PPI网络见图2，该网络共36个节点，166条边，平均节点度值为8.74。根据度值筛选出排序居前10位的关键蛋白靶点，见图3；其中，丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)8、白细胞介素(IL)6、表皮生长因子受体(EGFR)、MYC和雌激素受体1(ESR1)等5个靶点的度值均>2倍平均值。

图3 度值排序居前10位的核心靶点柱状图Fig 3 Histogram of the top ten core targets with degree value

2.4 GO功能富集分析

利用R语言对共同靶点从BP、MF和CC 3个水平进行富集分析，共得到1 076个GO条目(校正P<0.01)，将显著性排序居前10位的条目以条形图形式展示，见图4。BP共619个条目，涉及对类固醇激素的响应、对金属离子的响应、凋亡信号通路的调控、对氧化应激的响应、神经元死亡的调控和活性氧代谢过程的调控等；MF共35个条目，主要涉及DNA结合转录激活因子活性、组蛋白去乙酰化酶结合、泛素蛋白连接酶结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、核受体活性和半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡过程等；CC共13个条目，主要涉及膜筏、膜区、转录因子复合物、核染色质、髓鞘和细胞基部等。

A.BP；B.MF；C.CCA.BP；B.MF；C.CC图4 GO功能富集分析条形图Fig 4 Go enrichment analysis bar chart

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析共得到88条信号通路(校正P<0.01)，将显著性排序居前20位的通路以气泡图形式展示，见图5。主要涉及肿瘤坏死因子(TNF)、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)、MAPK、IL-17和核因子κB(NF-κB)等信号通路。

图5 KEGG富集气泡图Fig 5 KEGG enrichment bubble diagram

2.6 成分-靶点网络构建分析

成分-靶点网络见图6，该网络中共有118个节点，288条边，平均节点度值为4.80。图6中，圆形代表黄芪-川芎作用于SCI，矩形代表黄芪的活性成分，三角形代表川芎的活性成分，长方形代表基因靶点。网络拓扑分析结果显示，度值排序居前5位的活性成分为槲皮素、山柰酚、7-O-甲基异木糖醇、异鼠李碱和刺芒柄花素。黄芪-川芎作用于SCI的靶基因共38个，其中PTGS1、F2、HSP90AA1、PPARG和AR的度值均>2倍平均值。度值越大，说明关联数量越多，因此，可以推测上述成分和靶点在黄芪-川芎治疗SCI中具有重要意义。

2.7 关键靶点分子对接

根据上述成分-靶点网络，选取活性成分关联最多的共同靶点。PTGS1关联数量最多，且可同时连接黄芪活性成分槲皮素、山柰酚和7-O-甲基异木糖醇等，以及川芎有效成分亚油酸乙酯、杨梅酮。PTGS1与黄芪-川芎活性成分分子对接结果显示：槲皮素可以与PTGS1中ARG-120、TYR-385、TYR-355和VAL-523位点形成氢键，结合能为-28.42 kJ/mol；山柰酚在TYR-385、SER-530位点形成氢键，结合能为-27.59 kJ/mol；7-O-甲基异木糖醇在ARG-120、ILE-523和SER-530位点形成氢键，结合能为-26.75 kJ/mol；亚油酸乙酯在ARG-120、TYR-355位点形成氢键，结合能为-31.35 kJ/mol；杨梅酮在TYR-355、TYR-385、ALA-527和SER-530位点形成氢键，结合能为-13.79 kJ/mol。上述结果表明，各活性成分与PTGS1可良好的结合，PyMol软件制作的可视化图谱详细展示了分子对接情况，见图7。

3 讨论

SCI属于中医“体惰”“痿证”和“痹证”范畴，针对其病机特点，多采用三期辨证法，早期宜活血化瘀，中期多攻补兼施，晚期偏滋补肾脾[17]。黄芪为补气名药，川芎为“血中之气药”，两药配伍作为主要组成的最经典复方莫过于三期辨证中皆可加减应用的补阳还五汤。一项纳入26个随机对照试验的循证研究结果表明，中药治疗SCI有效且安全，其中补阳还五汤是最常用的复方，黄芪是最常用的单味药[18]。

本研究首先构建了PPI网络，分析结果表明，MAPK8、IL-6、EGFR、MYC和ESR1等5个靶点度值>2倍平均值，说明其可能为黄芪-川芎作用于SCI的核心靶点。检索相关文献发现，MAPK8是MAP激酶家族的成员，为多个生化信号的整合点，调节多条信号通路，在治疗SCI中可参与改善神经炎症、减轻细胞凋亡等过程[19]。IL-6是一种分泌蛋白，能刺激B细

胞产生抗体从多种途径刺激细胞，诱导炎症反应蛋白的合成，在脊髓损伤后引发的炎症反应中起到重要作用[20-21]。EGFR是上皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体，有证据表明其可促进SCI损伤区域神经元的生成[22]。MYC和ESR1都属于作用广泛的转录因子，可通过多种机制调节细胞的分化和增殖。研究结果表明，发生中枢神经系统损伤时，MYC可能通过促进轴突再生和生长，帮助修复损伤的神经细胞[23]。ESR1作为药物调控靶点在恶性肿瘤领域中研究广泛，有研究结果认为其突变表达了一种有利于肿瘤进展的独特转录谱[24]。值得注意的是，目前ESR1在神经疾病领域中的研究仍未见报道。

本研究中，GO功能富集分析结果提示，共同靶点主要参与了凋亡信号通路的调控、对氧化应激的响应、神经元死亡的调控和活性氧代谢过程的调控等BP，与上文所述核心靶点的生物学功能一致。KEGG通路富集分析中，PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和NF-κB信号通路被显著富集，结合核心靶点及GO功能富集分析结果，上述3条通路极有可能为黄芪-川芎治疗SCI所调控的关键通路。有研究结果显示，黄芪糖蛋白对急性脊髓损伤具有一定的神经保护功能，可降低脊髓组织氧化应激及炎症反应，可能与抑制NF-κB蛋白表达有关[25]。槲皮素通过抑制MAPK信号通路的激活，从而调节继发性氧化应激反应，对SCI具有保护作用[26]。川芎嗪可通过抑制MAPK通路的激活，抑制活性氧的过量产生，防止线粒体功能障碍[27]。此外，川芎嗪还在脊髓损伤后具有神经保护作用，其机制可能与抑制损伤后Akt磷酸化的降低有关[28]。

本研究中，成分-靶点网络主要分析了活性成分与对应靶点的关联性。活性成分方面，推测槲皮素、山柰酚、7-O-甲基异木糖醇、异鼠李碱和刺芒柄花素为治疗SCI的重要活性成分。研究结果表明，槲皮素可显著减少脊髓损伤后的髓鞘丢失和轴突丢失，还可促进电生理恢复，减少空洞形成，促进星形胶质细胞活化和轴突再生[29-30]。Liu等[31]认为，山柰酚可以降低SCI后的氧化应激和炎症反应，该机制与下调MAPKs-NF-κB和信号通路相关。Chen等[32]研究结果表明，异鼠李碱可通过减轻氧化应激和调节M1/M2巨噬细胞极化来促进SCI大鼠的功能恢复。7-O-甲基异木糖醇、芒柄花素对SCI治疗作用的研究甚少，这可能是未来研究的方向。成分对应靶点方面，PTGS1关联数量最多，且可同时连接黄芪活性成分和川芎有效成分。PTGS1编码的蛋白质调节内皮细胞的血管生成，且可能在肿瘤进展过程中促进细胞增殖。研究结果表明，PTGS1与出血、血小板功能障碍以及调控脂肪干细胞在损伤部位的定向分化有关[33-34]。分子对接技术可以通过计算结合能量值评估小分子与靶蛋白的结合亲和力，负值时提示两者可有效结合[35]。本研究的分子对接结果显示，PTGS1与活性成分槲皮素、山柰酚、7-O-甲基异木糖醇、亚油酸乙酯和杨梅酮均具有良好的亲和力。上述结果提示PTGS1可能是一个潜在的关键靶点。

综上所述，本研究对黄芪-川芎治疗SCI的作用机制进行了预测，其可能与抗炎、抗氧化应激、抗神经元凋亡及调控PI3K-Akt信号通路等多途径多通路相关。未来，课题组将通过实验研究进一步验证网络药理学结果的可靠性，并且深入揭示其作用机制。