不同C/N条件下菌酶制剂对牛粪堆肥中细菌多样性的影响

梁天，张晓东，张玉，张佐忠，斯日古楞，苏布登格日勒，娜仁花

（内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018）

堆肥是由细菌、真菌和其他微生物共同作用分解有机物质的过程。为了加速生物性降解，通常接种几种功能菌株进入堆肥中，以加快腐殖质的形成和缩短堆肥周期[1]。在堆肥初期，畜禽粪便中土著微生物含量少，且厌氧菌在系统中占据优势，导致堆体升温缓慢，并容易产生恶臭，而添加外源微生物菌剂后可明显改善这一现象。Zhao等[2]研究认为，接种有助于提高初始微生物种群和加快堆肥成熟进程。Sarkar等[3]报道，接种可以延长堆肥高温期，提高细菌和真菌群落的多样性，进一步增加腐殖酸和类黄腐酸化合物的分子量和腐殖化程度。此外，外源微生物接种不仅可以增加堆肥过程中的微生物活性进而促进堆肥的成熟，而且还可以提高有效微生物浓度，从而迅速提高堆肥速率、温度，并提高底物特异性微生物的丰度[4]。

在堆肥过程中，有机物降解和腐殖质的形成都离不开微生物酶的生物化学作用，通过有目的的腐解作用，将有机物转化为养分和活性物质。任平等[5]研究发现，添加复合酶处理可促进牛粪堆肥前期纤维素类物质的分解转化，从一开始就对整个发酵起到积极作用。酶对堆肥内纤维素物质的快速降解有利于好氧微生物的快速增殖，从而迅速分解物料中的有机质，产生大量的生物热，加速物料的升温，延长发酵的高温期，进而缩短发酵周期。

本研究通过不同C/N条件下，在牛粪中添加不同菌种和酶剂组合，探究在牛粪堆肥进程中细菌的多样性演替变化规律，以期为堆肥高效发酵提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛粪和小麦秸秆均取自内蒙古某奶牛养殖场。将小麦秸切碎至1～2cm长度。菌剂包括枯草芽孢杆菌（有效活菌数200亿/g）、黑曲霉菌（有效活菌数50亿/g）、细黄链霉菌（有效活菌数50亿/g），3种菌配制成比例为1:1:1的复合菌剂。将纤维素酶（有效酶活为20万U/g）和蛋白酶（有效酶活为50万U/g）配制成比例为3:1的复合酶制剂。三种菌和两种酶均购自湖北某生物工程有限公司。牛粪及小麦秸秆的基本性质见表1。

表1 堆肥原料的基本性质

1.2 试验设计

堆肥试验于2020年9月28日-11月1日在内蒙古某奶牛养殖场彩钢瓦棚中进行。将牛粪和小麦秸秆按一定比例混合，分别设25/1、30/1、35/1三个C/N组，每个C/N组设三个处理组，每个处理3个重复。按质量比添加菌剂和酶制剂，具体分组见表2。

表2 堆肥处理组物料配比情况

各处理组的含水量调节在45%～60%之间。将物料进行条垛式堆肥，每个堆体长1.2m，堆底宽1m，高0.8m，每堆的堆体间隔为1～2m。所有处理组每隔5d人工翻堆一次。

1.3 取样方法

在堆肥开始的第1、5、10、15、20、26、34天进行取样。采样深度分别距堆体顶部20cm、40cm、60cm处，各层均采用五点采样方法取样，取样后混合均匀。每个堆体取500g样品，放入自封袋中，置于-80℃冰箱中保存。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 发酵堆体中细菌多样性分析

通过高通量测序技术测定各处理组在堆体发酵过程中细菌多样性变化特征。

1.4.2 堆体微生物DNA的提取

根据FastDNA®Spin Kit for Soil（MP Biomedicals,GA, U.S.）说明书进行微生物群落总DNA抽提，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度。

1.4.3 堆体微生物目标基因扩增

细菌16S rRNA基因使用338F/806R进行扩增，引物序列如表3所示。

表3 PCR扩增引物碱基序列

1.4.4 细菌16S rRNA-PCR 扩增

细菌扩增反应体系见表4。

表4 细菌PCR扩增反应体系

扩增反应参数：95℃预变性3min，之后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，此步骤循环27次，然后72℃稳定延伸10min，最后保存于10℃。PCR扩增产物大小为468bp。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.5 微生物数据处理

利用FASTP软件对原始测序序列进行质控，用FLASH软件进行拼接。利用UPARSE软件对序列进行OTU聚类（相似度为97%）并剔除嵌合体。用RDP classifier对序列进行物种分类注释。使用美吉云平台进行图形制作与部分数据分析。

2 结果与分析

2.1 堆肥样品细菌OTU聚类分析和Alpha多样性分析

Venn图用来统计多组样本之间共有和独有的OTU个数，从而比较直观地表达不同组OTU组成的相似和重叠情况。如图1所示，处理组C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9组细菌分别有1795、1948、1931、1849、1969、1921、2220、1954、1927个OTU，每组共有的OTU为1207个，每组特有的OTU为C1组34个、C2组19个、C3组18个、C4组38个、C5组36个、C6组32个、C7组89个、C8组18个、C9组47个。

图1 细菌Venn图

堆肥样品中的细菌多样性分析（Alpha Diversity）见表5。其中Shannon（香侬指数）、Simpson（辛普森指数）可以反映微生物的多样性，Shannon值越高说明群落多样性越高，Simpson值越高说明群落多样性越低；Chao指数常用于估计物种的总数，从而反映物种平均丰度。与堆肥初期相比，堆肥末期各处理组Shannon指数、Chao指数均有增加，Simpson指数均有下降。堆肥各样品文库的覆盖率（Coverage）均超过98.60%。

表5 堆肥样品中细菌多样性

2.2 牛粪堆肥进程中门水平细菌菌群丰度分析

本研究中细菌门水平相对丰度大于1%的有9个，分别为放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、栖热球菌门（Deinococcota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、髌骨细菌门（patescibacteria）、黏球菌门（myxococcota）和Halanaerobiaeota菌门。随着堆肥进程的推进，不同门水平的细菌群落的相对丰度变化趋势见图2～4。

如图2所示，在堆肥初期（1d），C/N为25/1的C1、C2、C3组的第一优势菌群为放线菌门，相对丰度分别为46.43%、52.52%、46.48%。高温期（5d），C1、C2、C3组第一优势菌群演替为厚壁菌门，丰度分别为46.29%、54.94%、45.72%。堆肥结束时（34d），C1、C2组第一优势菌群演替为变形菌门，丰度为34.06%、33.30%，C3组第一优势菌群演替为放线菌门，为26.06%。

图2 C/N为25/1组细菌门水平的相对丰度

图3 C/N为30/1组细菌门水平的相对丰度

图4 C/N为35/1组细菌门水平的相对丰度

由图3所示，在堆肥初期（1d），C/N为30/1的C4、C5、C6组放线菌门相对丰度分别为52.27%、53.35%、50.86%，为优势菌群。高温期（5d），厚壁菌门成为第一优势菌群，丰度分别为51.58%、47.00%、60.57%。堆肥结束时（34d），C4组放线菌门再次成为第一优势菌群，丰度为53.35%，C5、C6组变形菌门成为第一优势菌，丰度分别为29.95%、31.00%。

由图4所示，在堆肥初始期（1d），C/N为35/1的C7、C8、C9组放线菌门细菌相对丰度分别为47.26%、50.05%、40.50%，为该时期的优势菌群。高温期（5d），3个处理组放线菌门细菌相对丰度均下降，厚壁菌门成为高温期第一优势菌群，丰度分别为39.90%、35.54%、60.36%。堆肥结束时（34d），C7组变形菌门成为第一优势菌群，丰度为29.49%；C8、C9组放线菌门再次成为第一优势菌群，丰度分别为37.12%、29.39%。

2.3 牛粪堆肥进程中纲水平细菌菌群丰度分析

本研究中细菌水平纲相对丰度大于1%的有14个，分别为放线菌纲（Actinobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、α-变性菌纲（Alphaproteobacteria）、梭菌纲（Clostridia）、恐球菌纲（Deinococci）、绿弯菌纲（Chloroflexia）、Halanaerobiia菌纲、Rhodothermia菌纲、Limnochordia菌纲、酸微菌纲（Acidimicrobiia）、Saccharimonadia菌纲、Polyangia菌纲。纲水平细菌群落相对丰度的变化见图5～7。

图5 C/N为25/1组细菌纲水平的相对丰度

图6 C/N为30/1组细菌纲水平的相对丰度

图7 C/N为35/1组细菌纲水平的相对丰度

如图5所示，在堆肥初始期（1d），C/N为25/1的C1、C2、C3组放线菌纲的相对丰度分别为45.81%、52.29%、46.21%，为第一优势菌群。高温期（5d），C1组优势菌群仍为放线菌纲，丰度为43.71%；C2、C3组芽孢杆菌纲成为第一大优势菌群，丰度分别为43.20%、38.57%。堆肥结束时（34d），C1、C2组γ一变形菌纲成为第一大优势菌群，丰度分别为28.10%、26.34%，C3组的优势菌群不变，仍为放线菌纲，丰度为24.27%。

如图6所示，在堆肥初始期（1d），C/N为30/1的C4、C5、C6组放线菌纲的相对丰度分别为52.14%、53.11%、50.72%，为该时期的第一优势菌群。高温期（5d），芽孢杆菌纲成为第一大优势菌群，C4、C5、C6组丰度分别为48.04%、43.06%、49.82%。堆肥结束时（34d），放线菌纲再次成为第一大优势菌群，C4、C5、C6组丰度分别为24.88%、25.64%、25.18%。

如图7所示，在堆肥初始期（1d），C/N为35/1的C7、C8、C9组放线菌纲相对丰度为47.12%、49.82%、40.35%，为该时期第一优势菌群。高温期（5d），C7、C8组放线菌纲仍为第一优势菌群，丰度分别为33.88%、30.19%；C9组芽孢杆菌纲成为第一优势菌群，丰度为51.17%。堆肥结束时（34d），放线菌纲再次成为第一优势菌群，丰度分别为27.45%、35.44%、27.94%。

2.4 牛粪堆肥进程中属水平细菌菌群丰度分析

本研究共得到19个细菌属，所有样品中属水平相对丰度均大于0.05%。包括棒杆菌属（Corynebacterium）、高温双岐菌属（Thermobifida）、芽孢杆菌属（Bacillus）、嗜盐单胞菌属（Halomonas）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、特吕珀菌属（Truepera）、Marinimicrobium属、乔治菌属（Georgenia）、肉杆菌属（Atopostipes）、嗜冷咸海鲜球菌属（Jeotgalicoccus）、未命名菌属（norank_f__Cellvibrionaceae属）、嗜热新芽孢杆菌属（Novibacillus）、未命名菌属（norank_f__JG30-KF-CM45属）、嗜盐菌属（Halocella）、热微菌属（Tepidimicrobium）、大洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）、薄壁芽孢杆菌属（Garcilibacillus）、费克蓝姆菌属（Facklamia）。没有科学名称细菌，以noran作为标记。属水平细菌群落的相对丰度变化见图8～10。

图8 C/N为25/1组细菌属水平的相对丰度

图9 C/N为30/1组细菌属水平的相对丰度

图10 C/N为35/1组细菌属水平的相对丰度

如图8所示，在堆肥初始期（1d），C/N为25/1的C1、C2、C3组棒杆菌属相对丰度分别为31.19%、42.15%、37.81%，为该时期第一优势菌群。高温期（5d），棒杆菌属丰度下降最大，C1、C3组芽孢杆菌属成为第一优势菌群，分别为31.07%、21.59%；C2组高温双岐菌属成为第一优势菌群，为19.93%。堆肥结束时（34d），C1、C2组嗜盐单胞菌属成为第一优势菌群，分别为8.80%、6.18%；C3组特吕珀菌属成为第一优势菌群，为6.60%。C1、C2、C3组在堆肥初始期嗜冷杆菌属相对丰度分别为5.08%、12.65%、10.54%，其他时期几乎检测不到。

如图9所示，在堆肥初始期（1d），C/N为30/1的C4、C5、C6组棒杆菌属相对丰度分别为45.33%、42.70%、42.28%，为该时期第一优势菌群，随着堆肥的进行棒杆菌属呈下降趋势。高温期（5d），C4组高温双岐菌属成为第一优势菌群，为13.23%；C5、C6组芽孢杆菌属成为第一优势菌群，分别为13.15%、13.77%。堆肥结束时（34d），C4、C6组乔治菌属成为第一优势菌群，为6.93%、5.54%；C5组芽孢杆菌属成为第一优势菌群，为6.77%。

如图10所示，在堆肥初始期（1d），C/N为35/1的C7、C8、C9组棒杆菌属相对丰度最大，分别为41.03%、41.17%、35.47%，为该时期第一优势菌群，随着堆肥的进行棒杆菌属呈下降趋势。高温期（5d），C7、C8组棒杆菌属仍为第一优势菌群，分别为12.70%、17.62%；C9组芽孢杆菌属成为第一优势菌群，为17.93%。堆肥结束时（34d），C7组高温双岐菌属成为第一优势菌群，为7.03%；C8、C9组乔治菌属成为第一优势菌群，分别为8.34%、7.40%。

3 讨论

微生物是堆肥物料的分解者，不同的优势细菌类群在堆肥进程中呈现菌群演替。本研究中，各处理组在堆肥结束时细菌群落的香侬多样性指数均呈增加的变化趋势，此结果与Ren等[6]的研究结果一致。主要是因为在堆肥的升温期产生了充足的营养物质，有利于细菌的生长和代谢[7]，致使该时期香侬指数的增加。当进入高温期后香侬指数下降，此时耐热细菌开始占据优势[8]，其他物种由于温度过高死亡。

细菌丰度结果显示，门水平的细菌群落多样性随堆肥进程有一定的改变。无处理组（C1组、C4组、C7组）在堆肥初期放线菌门为优势菌群，高温期演替为厚壁菌门。堆肥结束时，除C4组外，其他2组的优势细菌门均演替为变形菌门。添加菌酶制剂后（C2组、C3组、C5组、C6组、C8组、C9组），优势菌群在堆肥初期和高温期与无处理组相同，堆肥结束时，除C2组外，其他组优势菌群均又演替为放线菌门。放线菌门和厚壁菌门是堆肥初始期相对丰度最大的细菌门。在堆肥过程中，难被降解的纤维素和木质素含量较高，放线菌门能够有效降解纤维素、半纤维素和木质素，因此占据主导地位，这与Insam等[9]的研究结果相似。Steger等也提到，放线菌门可分解堆肥中有机物，并能释放与腐殖质产生有关的无机物[10]。因此放线菌门对于堆肥的腐熟起着重要的作用。本研究显示，无论C/N如何，添加菌酶制剂堆肥结束腐熟时均有助于增加放线菌门的丰度。厚壁菌门能够产生内生孢子[11]，所以它具有较高的耐受性[12]，能够生存在不适宜的环境中[13]，本研究中，各试验组在高温期优势菌群均为厚壁菌门。另外，拟杆菌门和变形菌门也占一定主导地位。有研究表明拟杆菌门中很多种细菌都具有降解大分子有机物的能力，包括纤维素、淀粉和几丁质等[14]，本试验中，牛粪及小麦秸秆均含有较多的纤维素，为拟杆菌门细菌生长代谢提供了充足的营养物质。变形菌门是细菌中最大的类群，具有固氮和降解木质素等多种功能，在堆肥各时期均有大量的分布。本研究表明，这四种细菌门占总鉴定序列的90%以上，这与Tortosa等[15]研究结果一致，表明这四种细菌门对堆肥过程中的有机物分解起主要作用[11,16]。

本研究的优势纲共有14个，放线菌纲是所有处理组在堆肥初始期相对丰度最大的优势菌纲。芽孢杆菌纲对高温的耐受性较高，能够在45～70℃温度范围内生长繁殖[17]，会在高温期明显增加。本试验在高温期除了C8组的优势菌为放线菌纲外，其他处理组优势菌群均为芽孢菌纲。而放线菌纲在堆肥的整个阶段起着重要作用，尤其在对于难降解化合物的降解和和腐殖质的形成过程中[18]。除在堆肥末期C1组、C2组的γ一变形菌纲成为第一大优势菌群外，其他处理组优势菌群再次演替为放线菌纲，尤其是C/N为25组变化较为一致。

在本研究中，优势菌属共有19个，这些细菌属在自然环境以及人为环境中分布广泛，包括土壤和许多堆肥体系[19,20]。在堆肥初始期，糖类、淀粉和蛋白质等易降解成分得到迅速分解；半纤维素、纤维素及木质素等难降解物质开始缓慢分解。该时期主要是嗜温微生物占优势，而棒状杆菌属属于堆肥嗜温期优势微生物。本试验同样显示了各组的棒杆菌属相对丰度最大，为该时期第一优势菌群。高温期嗜热微生物迅速繁殖成为优势菌落，进而对结构复杂的半纤维素、纤维素及木质素等进行分解。而在嗜热期优势菌群大多分布于高温双岐菌属、嗜热霉菌属、曲霉属、泛菌属、芽孢杆菌属、糖单胞菌属等[21]。芽孢杆菌属能够产生孢子来抵御高温环境，由于高温期堆体中噬中温细菌因不耐高温而大量死亡，所以使其相对丰度增加。本研究结果显示，在高温期除了C7、C8组的第一优势菌群仍为棒杆菌属外，其他处理组优势菌群演替为芽孢杆菌属和高温双岐菌属。堆肥结束时优势细菌多样性增加，转变成嗜盐单胞菌属、特吕珀菌属、乔治菌属、芽孢杆菌属、高温双岐菌属。

4 结论

本研究中各试验组细菌多样性随不同的堆肥进程呈现高-低-高的趋势。堆肥初期，各组优势细菌门均为放线菌门，添加菌酶制剂处理组的放线菌门丰度大于无添加处理组。高温期时，各组优势菌门均为厚壁菌门，但各组之间厚壁菌门丰度变化不一致。堆肥结束时，除C2组外，其他组优势菌群均又演替为放线菌门。在堆肥初始期、高温期及结束期各组菌群基本是放线菌纲-芽孢菌纲-放线菌纲的演替规律。堆肥初期，各组优势菌属均为棒杆菌属，但组间棒杆菌属丰度变化不一致。在高温期除了C7、C8组的第一优势菌群仍为棒杆菌属外，其他处理组优势菌群演替为芽孢杆菌属和高温双岐菌属。堆肥结束时优势细菌多样性增加，转变成嗜盐单胞菌属、特吕珀菌属、乔治菌属、芽孢杆菌属、高温双岐菌属。