UV法测定替格瑞洛分散片的含量均匀度*

张 丽，李 勇，王 昆，张 伟**

(1.昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500；2.昆明龙津药业股份有限公司，云南 昆明 650503)

替格瑞洛是由英国阿斯利康(AstraZeneca)公司研发的一种口服新型强效抗血小板药物，是第一个可逆地P2Y12受体拮抗剂[1]，临床上主要用于急性冠脉综合征 (ACS) 患者及心脑血管血栓事件的预防和治疗。替格瑞洛在2011年获FDA批准，自批准上市以来，因其独特的药效学、药动学和药理学特征[2-3]，在临床上被广泛应用，是我国公立医疗机构终端前10抗血栓药物产品之一[4]。替格瑞洛分散片是阿斯利康推出的一款新剂型，于2017年5月获欧盟委员会批准，2020年9月正式在中国获批进口上市。该剂型既可用于常规抗血小板治疗的患者 ，也可用于只能通过插管法治疗，或对薄膜衣片有吞咽困难的患者。当患者急需用药时，分散片无需压碎药片或者寻找饮用水，避免将药丸压碎使用，保障患者按量用药。同时，ACS患者受疾病特点、年龄、治疗方式、给药时间和给药方式等因素的影响[5-6]，如疾病群体以中老年人为主，患者大多需进行经皮冠状动脉介入治疗(PCI)，且患者多为急危重症，常伴有昏迷、心梗等并发症[7]。因此，替格瑞洛分散片的研发和使用可为ACS患者提供一种更安全、更有效、更方便的给药替代方法。经查阅相关文献资料和现有质量标准，当前对替格瑞洛分散片的质量分析研究较少，尤其在含量测定方面的研究。现行质量标准和文献资料中[8-10]，主要以高效液相色谱法测定替格瑞洛含量和含量均匀度。HPLC法专属性强，灵敏度高，但使用该方法做检测分析存在一些不足之处，如操作繁琐、耗时长、需要大量有机溶剂，增加试验周期,同时也不环保[11]。另外，从成本上考虑，与紫外分光光度法相比，该方法耗资大幅增加。因此，本研究拟采用UV法测定替格瑞洛分散片的含量均匀度，以期开发一种简便快捷、准确、经济、环保的检测分析方法，同时可为替格瑞洛分散片相关质量研究提供一定科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ThermoEvolution350紫外/可见分光光度计(美国Thermofisher Scientific公司)；Shimadazu UV-2600i紫外可见分光光度计(日本岛津仪器有限公司)；Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；SECURA225D-1CN型赛多利斯电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；SK8300GT超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 试药

替格瑞洛对照品(昆明龙津药业股份有限公司标定，批号：ZM032020001-F02，纯度：100%)；替格瑞洛分散片(昆明龙津药业股份有限公司，规格：90 mg，批号：20210830、20210903、20210907)；空白辅料(昆明龙津药业股份有限公司，批号：20210829)；聚四氟乙烯(PTFE)滤膜(天津津腾试验设备有限公司)；乙腈(色谱纯，默克股份两合公司)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液

取替格瑞洛对照品 15 mg，精密称定，置于 100 mL 量瓶中；加溶剂[乙腈-水(体积比35∶65)]适量，超声使替格瑞洛溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取 5 mL，置于 50 mL 量瓶中，加溶剂[乙腈-水(体积比35∶65)]稀释至刻度，摇匀，制成 15 μg/mL 对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

取本品10片，分别置于 200 mL 量瓶中，加溶剂[乙腈-水(体积比35∶65)]适量，使替格瑞洛溶解，用溶剂[乙腈-水(体积比35∶65)]稀释至刻度，摇匀，经 0.45 μm 滤膜(PTFE)滤过。精密量取续滤液 1 mL 置于 30 mL 量瓶中，摇匀，制成 15 μg/mL 供试品溶液 。

2.1.3 空白辅料溶液

按制剂处方比例和制备工艺，制成不含替格瑞洛的空白辅料。取该空白辅料 100 mg(约相当于替格瑞洛 15 mg)，精密称定，同“2.1.1”项下对照品溶液制备方法同法操作，即得。

2.2 测定原理和方法

2.2.1 测定原理

按公式(1)计算替格瑞洛的质量浓度：

(1)

将上述测得的替格瑞洛质量浓度代入公式(2)中，即可计算出替格瑞洛的含量：

(2)

式中：V为稀释体积 200 mL；m为替格瑞洛分散片标示质量 90 mg。

2.2.2 测定方法

按照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2020年版四部通则0401[12])在所选检测波长 300 nm 处依次测定空白溶剂、空白辅料溶液、对照品溶液和供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性及检测波长选择

取“2.1”项下制备的对照品溶液、空白辅料溶液及空白溶剂[乙腈-水(体积比35∶65)]在190～500 nm 波长范围内进行紫外光谱扫描，结果见图1。从图1可知，在222、256和 300 nm 波长处有最大吸收，其中，样品在 300 nm 波长处无吸收干扰，因此本试验选定 300 nm 作为替格瑞洛分散片检测波长，且空白溶剂和空白辅料不影响主药成分含量均匀度测定。

图1 替格瑞洛、空白辅料、空白溶剂紫外吸收光谱扫描图

2.3.2 线性关系考察

精密称取替格瑞洛对照品 15.62 mg，置于 100 mL 量瓶中，加溶剂[乙腈-水(35∶65,体积比)]溶解并稀释至刻度，得到质量浓度为 156.2 μg/mL 时对照品溶液。分别精密量取上述溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL 至 50 mL 量瓶中，加溶剂[乙腈-水(体积比35∶65)]稀释至刻度，摇匀，得到系列质量浓度溶液。在 300 nm 波长处测得系列质量浓度溶液吸光度值A。以质量浓度(ρ，μg/mL)为横坐标，吸光度值A为纵坐标，进行线性回归处理，得线性回归方程：A=0.0318ρ+0.0017，其中r= 0.999 9(n=8)。结果表明，替格瑞洛在3.1240～24.992 μg/mL 范围内与吸光度线性关系良好。

2.3.3 精密度试验

取同一供试品溶液(批号20210907)，在 300 nm 波长处连续扫描6次，记录吸光度，测得平均吸光度为0.497，RSD为0.08%(n=6)。结果表明，该仪器精密度良好，能较好满足测试要求。

2.3.4 重现性试验

取本品(批号20210903)，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别在ThermoEvolution 350紫外/可见分光光度计和Shimadazu UV-2600i紫外/可见分光光度计上，由不同分析人员测定吸光度。其中，在ThermoEvolution 350紫外/可见分光光度计上测得替格瑞洛分散片平均标示量为100.25%，A+2.2S为1.57。Shimadazu UV-2600i紫外/可见分光光度计上测得替格瑞洛分散片平均标示量为99.78%，A+2.2S为1.25。结果表明，该方法重现性良好。

2.3.5 回收率试验

1)对照品贮备液制备。取替格瑞洛对照品 1800 mg ，精密称定，置 100 mL 量瓶中，制备成 18 mg/mL 的对照品贮备液。

2)供试品贮备液制备。取12个 200 mL 容量瓶(编号为1～12)，按制剂处方比例制备空白辅料，各加入空白辅料约 510 mg，分别精密量取对照品贮备液3.5、5.0、6.5、7.5 mL 分别加入1、2、3号样品，4、5、6号样品，7、8、9号样品,10、11、12号样品中，制备成70%、100%、130%、150%的供试品溶液，测定各溶液吸光度并计算回收率及其RSD，结果见表1。替格瑞洛的平均回收率为101.75%，RSD为0.92%(n=12)。

2.3.6 稳定性试验

取本品(批号20210907)，按“2.1.2”项下供试品溶液配制方法，制备供试品溶液，室温、避光下放置，分别在0、2、4、6、8、10、12 h 测定吸光度。结果表明，样品吸光度基本保持不变，RSD为0.25%(n=7)，样品在 12 h 内稳定。

2.4 替格瑞洛分散片含量均匀度的测定

取本品3批(批号：20210830、20210903、20210907)，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项下测定方法进行样品含量均匀度测定。另参照《欧洲药典》第10.4版[9]和《替格瑞洛片中国进口药品注册标准》[10]按高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512[12])测定相同3批替格瑞洛分散片含量的均匀度。色谱条件为：以Agilent Zorbax SB-C18(150×φ4.6 mm，1.8 μm)为色谱柱；流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈(48∶52,体积比)；流速：1.2 mL/min；检测波长：242 nm；柱温：55 ℃，结果见表2。从表2可知：两种方法测得不同批次替格瑞洛分散片含量均匀度均符合规定[12](A+2.2S≤15)，测定结果基本一致。本试验建立的UV法与HPLC相比，测定结果无明显差异，该方法准确可靠、易行。

3 讨论

3.1 检测波长和检测浓度的选择

鉴于采用紫外分光光度法测定样品吸光度读数，以0.3～0.7之间为宜，因此需将供试品溶液稀释至一定质量浓度，以保证准确测量[13]。本试验前期对检测浓度进行探索，最终选择检测质量浓度是 15 μg/mL，其吸光度在0.5左右，符合朗伯-比尔定律。根据紫外吸收光谱扫描图可知，替格瑞洛具有较强的紫外吸收，尤在222、256和 300 nm 波长处有最大吸收，其中空白溶剂和辅料在 300 nm 波长处无吸收干扰，故本试验选择 300 nm 作为最终检测波长。

3.2 溶剂的选择

替格瑞洛为生物药剂学分类Ⅳ类药物，即难溶性药物，几乎不溶于水。因此选择在水中加入一定量的有机试剂乙腈，最终选择乙腈-水(35∶65,体积比)作为溶剂，能较好溶解替格瑞洛。

3.3 UV法和HPLC法比较

本研究表明，UV法和HPLC法测得相同三批样品的含量均匀度均符合要求，两种方法测得结果基本一致。目前，现有质量标准及相关文献资料主要采用HPLC法测定其含量及含量均匀度[8-10]，该方法灵敏、专属性较强[13]，但试验耗时长，费用高，增加劳动和经济成本，这与仿制药研究中经济性原则不相符[14]；同时，试验中需使用大量对人体有害的有机试剂如乙腈、甲醇，不环保和不健康[11]。与HPLC法相比，本试验所建立的UV法，快速、可节省试验时间，成本低，检测效率高，降低人力和物力成本，有其独特优势。

3.4 替格瑞洛分散片含量及含量均匀度测定方法建议

本试验对所建立的UV法测定替格瑞洛分散片含量均匀度进行方法学考察，所选检测波长处，辅料无吸收干扰，专属性高，线性关系和精密度均良好，回收率试验RSD值较小。该方法操作简单、快速、经济、准确度高、健康环保，能满足药物分析检验要求，可用于替格瑞洛分散片含量均匀度测定，同时可为该药物的质量分析研究提供一定科学依据。