杀线虫活性放线菌的筛选及鉴定

朱国兴，焦 钰，吴雅杰，樊炳君，叶秀娟，曹艳茹, 2, 3*

(1.昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214；2.昆明学院 农业资源利用科技创新团队，云南 昆明 650214；3.云南省高校蛭类资源开发与利用工程研究中心，云南 昆明650214)

线虫病是一种分布较广的土传病害，其具有种类多、传播途径广、繁殖能力强、危害程度大、寄主范围广和休眠体存活时间长等特点[1-3]．目前，已知的线虫种类有100多种，可侵染的植物高达 5 000 种，大多数蔬菜、作物都能成为根结线虫的寄主．根结线虫主要通过风、灌溉水、种子、农用器械操作不当以及单一作物种植等方式传播[4-5]，给农业、园林园艺等产业造成巨大损失，全世界每年因线虫造成的经济损失高达 1 570 亿美元[6]．线虫已被多数国家列为植物检疫对象．

目前，对线虫病的防治手段主要有农业防治、物理防治、化学防治和生物防治[7]．传统的农业防治通过轮作、间作、选用无虫地块育苗等方式防治根结线虫，但该方式见效慢、时间长、防治效率低，很难控制线虫病的发生和危害．物理防治主要通过高温闷棚、水淹处理等方式进行防治，方法虽然简便易行，但无法杀死土壤更深层的线虫和虫卵．化学手段是目前最主要的线虫防治方法，化学杀虫剂能够短时间内快速杀死线虫，但杀虫剂的普遍使用带来了农残高、易造成人畜中毒、农业面源污染、线虫易产生抗药性等一系列问题[8]．而生物防治有着不易产生抗性及生态安全等优点[9-10]，生防微生物作为生物防治的方式之一，近年来已逐渐成为研究热点．目前，常用的微生物源杀虫剂主要有两大类，一类是以淡紫拟青霉为代表的真菌杀线虫剂，其不仅可以杀死幼虫，而且还可以杀死成虫[11]；另一类是以阿维菌素为代表的微生物代谢产物制剂．目前杀线虫商品微生物制剂品种数量较少，挖掘对线虫具有生物活性的优良微生物菌株，可为高效生物杀线虫菌剂的开发提供研究资源．然而，常规环境下的微生物菌种已被国内外的科研工作者反复筛选和利用，因此从特殊环境或者微生物研究较少的生境中寻找新的活性菌株是快速获得目标微生物的有效途径[12-13]．

放线菌(Actinomycete)在自然界中分布广泛，其可以产生多种具有生物活性的次级代谢产物．世界上已发现的抗生素大约有2/3是由放线菌产生的[14-17]，杀线虫农用抗生素—阿维菌素就是由链霉菌(Streptomycesavermitilis)发酵产生．为了挖掘更多活性放线菌资源，人们把目光转向了特殊环境或者微生物研究较少的生境，例如：陈聪聪等[18]用稀释涂布平板法对采自青岛近海海域的样品进行放线菌分离，经筛选得到HT-8(Streptomycestermitum)线虫校正死亡率为88.30%；阿尔新等[19]从新疆高盐环境—阿勒泰福海县盐场和罗布泊中分离获得了14株具有杀线虫活性的放线菌；曾庆飞等[20]从海南东寨港红树林等生境分离得到的放线菌DA07118杀线虫活性高达100%．

云南轿子山地处昆明北部东川区与禄劝县交界处，海拔 4 344.1 m，被誉为滇中第一高峰，地形复杂，是探究生物多样性分布格局及其影响因素的理想之地[21]．轿子山自然保护区还具有滇中地区最为完整和丰富的植被以及生境垂直带谱，是一个巨大的天然物种基因库，目前已有对该地动物和植物的相关调查报道，但对于组成轿子山生态系统重要一员的微生物研究却为空白．轿子山土壤类型较丰富，有红壤、黄棕壤、棕壤、暗棕壤、棕色针叶林土以及亚高山草甸土等类型[22]，加之大面积连片存在的多种原生植被类型，成了放线菌资源筛选的理想生境．白云鄂博稀土矿为本实验样品的另一个来源．白云鄂博位于内蒙古高原南部，海拔为 2 000～3 000 m，该矿区为一座大型的铁、铌、稀土等多种金属共生矿，其稀土元素资源量占世界上已知稀土元素资源总量的2/3以上[23]．白云鄂博稀土矿长达60余年的露天开采，致使周围环境累积了大量重金属和放射性元素，形成了典型的极端环境[24-26]．樊永军等[27]从白云鄂博稀土矿分离出14株耐高辐射元素放线菌；曹艳茹等[28-29]从该矿区分离得到新种Actinorectisporametalli和Kibdelosporangiummetalli．这表明白云鄂博稀土矿存在特殊的菌种资源，但目前尚未见到对白云鄂博稀土矿放线菌杀线虫活性菌株的研究报道．

本研究利用稀释涂布平板法对轿子山自然保护区和白云鄂博稀土矿的放线菌进行分离，并筛选分离放线菌的杀线虫活性，以期为杀线虫菌剂的研发提供菌种资源．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤采集

将从轿子山自然保护区和白云鄂博稀土矿采集得到的90份样品置于无菌袋中，4 ℃保存以待分离．

1.1.2 供试线虫

秀丽隐杆线虫由于具有繁殖简单、生命周期短、基因组小、透明易观察、体积小易操作等优点，作为生物模型被广泛用于农业生防、细胞生物学、神经科学和衰老研究等领域．此外，秀丽隐杆线虫操作简单、廉价、生命周期短的优点为本实验的顺利开展提供了保障．

在进行杀线虫活性筛选时，先对线虫进行活化．用竹签挑取带有线虫的块状培养基，接种在涂布有250 μL大肠杆菌的NGM培养基上，20 ℃培养1 d后显微观察．对处于排卵期的线虫进行同步化处理并继续培养至2龄幼虫进行洗脱备用．

1.1.3 放线菌分离培养基

根据放线菌的营养特点，选用改良HV培养基[30]、改良Bennet培养基[30]、小米液体培养基[30]、BP培养基[30]、淀粉酪蛋白培养基[31]、几丁质培养基[31]、可溶性淀粉-酵母提取物培养基[32]、牛肉膏蛋白胨培养基[33]、高氏1号培养基[33]、无机盐淀粉琼脂培养基[34]共10种培养基进行放线菌的分离．

1.1.4 放线菌发酵培养基

采用改良酵母膏-麦芽汁液体培养基进行放线菌发酵液制备.培养基配方如下：酵母膏4 g、麦芽膏5 g、葡萄糖4 g、胰蛋白胨2 g、植物蛋白胨 1 g、微量盐1 mL、复合维生素微量，pH7.3， 121 ℃ 灭菌30 min．

1.2 方法

1.2.1 放线菌分离

每份样品称取2 g，自然风干7 d，100 ℃干热处理1 h．加入装有18 mL无菌水的三角瓶中，于28 ℃、200 r/min摇床震荡30 min得到土壤悬液，再进行10倍梯度稀释，稀释至104倍．吸取0.2 mL稀释液涂布于分离培养基上，于28 ℃培养30 d，挑取、纯化菌株后，接种于改良酵母膏-麦芽汁斜面培养基和甘油管于4 ℃、-80 ℃保藏．

1.2.2 放线菌鉴定

观察菌落特征.根据菌落大小、形态、颜色、边缘整齐度以及色素等进行初步去重复后，采用酶法提取菌株总DNA[35]后，以细菌通用引物(上游引物PA：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物PB：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)进行16S rRNA基因的特异扩增[36]，产物检测合格后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序．测序结果利用EZ BioCloud网站[37]进行比对后确定放线菌分类地位．

1.2.3 放线菌发酵滤液的制备

挑取已经鉴定的放线菌单菌落接种至装有100 mL改良酵母膏-麦芽汁液体培养基中，28 ℃，200 r/min培养7 d． 5 000 r/min离心5 min去除菌体，取上清液，于4 ℃冰箱保存备用．

1.2.4 杀线虫活性放线菌筛选

向24孔透明板中分别加入300 μL发酵滤液和10 μL线虫洗脱液(含线虫约60条)混合均匀，放入20 ℃恒温培养箱进行培养．每株菌3次重复，以改良酵母膏-麦芽汁液体培养基和清水为对照．12，24，36，48 h后镜检，记录各处理组的线虫死亡情况．线虫保持S形且活跃运动即为存活；僵直不动，用牙签或挑针戳动仍然僵直不运动，再使用清水复活后仍不动则判为死亡．线虫致死率为：致死率=[(处理前活线虫数量-处理后活线虫数量)/处理前活线虫数量]×100%[38]．对初筛有杀线虫活性的放线菌再次发酵，并按上述方法进行复筛验证．

2 结果与分析

2.1 放线菌的分离结果

从轿子山土样和白云鄂博稀土矿样品中分离得到586株菌，经16S rRNA基因测序鉴定去重复后，共获得257株放线菌，隶属24科，37属，见表1．

本次分离获得最多的放线菌是链霉菌属(36株)，占分离菌株的14.0%；假诺卡氏菌属(30株)次之，占11.7%；野野村菌属(27株)第3，占10.5%；而诺卡氏菌属(23株)、韩国生工菌属(20株)、小单孢菌属(18株)、拟无枝酸菌属(16株)分别占8.9%，7.8%，7.0%，6.2%．

本研究共获得稀有放线菌[39-40]221株，占分离菌株总数的85.99%，这表明轿子山土样和白云鄂博稀土矿蕴藏着丰富的放线菌资源，可为杀线虫生防菌株的筛选提供丰富的菌种材料．

2.2 放线菌对秀丽隐杆线虫J2的活性筛选结果

利用24孔板筛选分离放线菌发酵液的杀模式生物秀丽隐杆线虫活性，发现在供试的257株放线菌中，有33.46%的菌株即86株放线菌发酵液有杀线虫活性，其中有23株菌杀线虫致死率达50%以上，见表2．

表1 分离菌株的属分布

表2 杀线虫致死率在50%以上的放线菌信息

假诺卡氏菌属是本研究分离最多的稀有放线菌类群(30株)，占分离菌株的11.7%．由于该属菌株多数能产生抗生素[41]、免疫调控因子[42]以及降解芳香烃类[43]、卤代化合物[44]、环醚污染物等[45]，因而在生物技术、制药、农业和环境修复等领域备受关注．本研究分离到的30株假诺卡氏菌中，KC 97，KC 113，KC 16，KC 214(表2)对秀丽隐杆线虫的致死率达50%以上，且4株菌都为首次报道对秀丽隐杆线虫有致死活性，其中KC 97(Pseudonocardiaseranimata)对秀丽隐杆线虫的致死率则高达90%，具有较大的线虫生防菌剂开发潜力．

此外，本研究分离获得的小单孢菌属菌株也较多，有18株，占分离菌株的7.0%．小单孢菌属菌株产生的活性次级代谢产物多达700多种，如刺孢霉素和庆大霉素[46]以及能抑制沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌、耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的次级代谢产物[47]．在本研究分离到的18株小单孢菌中，筛选到KC 107和KC 36对秀丽隐杆线虫的致死率达80%以上，KC 161和KC 52对秀丽隐杆线虫的致死率为50%以上(表2)，均为首次报到其对线虫有致死活性．

其他类群的稀有放线菌，如KC 119(Amycolatopsisalba)能够产生新的抑菌活性和细胞毒活性的吡啶盐衍生物[49]、KC 250(Kibdelosporangiumaridum)能产生杀死肠道病毒的活性多肽化合物、KC 28(Nocardioidesluteus)能将脱乙酰巴卡汀III转化成浆果赤霉素III等，本研究首次发现了以上菌株具有较好的杀线虫活性(表2)，且是杀线虫生防菌剂开发的潜力菌株．

经16S rRNA基因测序和序列比对[50]，分析了对秀丽隐杆线虫(J2)致死率在70%以上的5株活性放线菌的系统进化地位(图1)．由图1可以看出，KC 97，KC 113分别与Pseudonocardiaseranimata和Pseudonocardiarhizophila聚在一支，且都被高达99%的自举值所支持；KC 36和KC 107分别与Micromonosporapeucetia和Micromonosporaechinofusca聚在一支，且分别被100%和99%的自举值所支持；杀线虫致死率为75%的KC 240与Saccharothrixespanaensis聚为一支，自举值为96%．以上高自举值表明了5株菌系统进化分析的稳定性和可靠性．

图1 对秀丽隐杆线虫致死率高于70%的放线菌16S rRNA基因系统发育树

3 讨论与结论

3.1 讨论

根结线虫是农业特尤其是蔬菜的主要病害之一，每年给农业产业造成巨大的经济损失．由于农业防治和物理防治效果不理想，而化学防治危害性大，易造成环境污染、农药残留、抗药性等一系列的负面效应，因此生物防治已成为目前重视程度较高、研究较多的一种防治措施，且该防治方法符合生态农业、环境友好的现代理念．目前，根结线虫的生物防治研究虽然已取得了一定成果，但很多研究仍处于实验阶段，应用于农业生产的产品较少．此外，见效慢、易受环境影响等问题使得生物防治的开发利用还有待进一步研究．

本研究从稀土元素含量高、辐射较强的白云鄂博稀土矿和生物资源较丰富的轿子山两地采样，共分离获得257株放线菌，其中有86株放线菌发酵液有杀线虫活性，杀线虫致死率达50%以上的菌株有23株．假诺卡氏菌属的KC 97(Pseudonocardiaseranimata)和KC 113(Pseudonocardiarhizophila)对秀丽隐杆线虫(J2)的致死率分别高达90.0%和87.0%．Pseudonocardia(假诺卡氏)属菌株能产生很多有用的代谢产物，如杀菌素、新的制霉菌素的衍生物、萜烯类化合物、铁载体、杰鲁霉素等[51-52]，本研究首次发现了该属菌株具有较好的杀线虫活性．KC 107(Micromonosporaechinofusca)和KC 36(Micromonosporapeucetia)对秀丽隐杆线虫(J2)的致死率分别为87.0%和82.4%，其中KC 36发酵液处理线虫12 h的致死率达到了82.4%，表明该菌具有高效杀线虫的潜力．KC 240(Saccharothrixespanaensis)发酵液的线虫致死率为75.0%.Kalinovskaya等[48]早先报道了Saccharothrixespanensis能产生新的安古环素和抗菌活性的二酮哌嗪类化合物，而本研究首次报道了该菌株具有杀线虫活性．

3.2 结论

保障国家农产品安全是一个永恒课题，需要大家不断为之努力．本研究共分离获得257株放线菌，隶属37属、24科，其中有5株放线菌菌株KC 97(Pseudonocardiaseranimata),KC 113(Pseudonocardiarhizophila),KC 107(Micromonosporaechinofusca),KC 36(Micromonosporapeucetia)和KC 240(Saccharothrixespanensis) 具有较高的杀线虫活性，为线虫病害的生物防治菌剂开发提供了丰富的微生物菌种资源．但这5株放线菌的杀线虫活性物质、杀虫机制以及生防菌剂的研发等仍需进一步探索，以期为农业生产中的线虫病害防控提供理论基础和研究资源．