枸骨根际放线菌ZY-2的分离鉴定及其抑菌活性检测研究

査艳景，姜国银，张炳炎，杨本寿*

(1.曲靖医学高等专科学校 微生物研究所，云南 曲靖 655000；2.云南省遗传学会，云南 昆明 650091)

枸骨(IlexcornutaL.)名猫儿刺、八角刺、老虎刺、鸟不宿、枸骨刺等，四季常青，可用于绿化.其为被子植物门(Angiospermae)双子叶植物纲(Dicotyledons)无患子目(Sapindales)冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(Ilex)植物，主要分布于长江下游各省[1].枸骨是一种常用中药，其叶、树皮、果实、根均可入药，在常见病痛治疗方面有较好疗效[2].枸骨叶清热养阴、益肾、平肝，可用于治疗肺痨咯血、骨蒸潮热、头晕目眩等症状[3].

根际是植物-土壤-微生物信息和物质交换的重要场所,是土壤对植物根系的生命活动和代谢影响最直接、最显著的区域.根际微生物对植物的生长发育、抗逆性以及病虫害防治等方面都具有非常重要的作用[4-5]，因此，根际微生物组被视作植物的第二基因组.当前，对植物宿主、根际微生物和其他土壤微生物间相互作用和关系的研究属于全球关注的热门和研究的热点[6-8].

目前，植物菌害防治的方式主要以化学防治为主，但是长期施用化学农药会带来农药残留、病原菌抗药性增强、生物多样性受破坏、农产品品质下降、病害发生易反复等负面影响[9-11].而利用生防菌进行植物病害的防治则具有对环境安全的优点，因此，对生防菌的相关研究[12-14]是新农药研究和创制的方向之一.放线菌是一类重要的生防菌，是抗生素最重要的生物来源.在现今发现的2万多种微生物来源的天然抗生素中，约有40%由放线菌产生[15-16].而在应用于临床的天然抗生素中，约有70%来源于放线菌的次级代谢产物[17].且自然界中放线菌种资源十分丰富，尽管目前有新的放线菌种不断被发现，但仍然不足自然界中放线菌种类总量的1%[18].研究[19-22]表明，许多具有重要生物活性的放线菌是从植物根际土壤中分离得到的.本研究拟以枸骨根际土壤为研究对象，以期在其中发掘出放线菌资源用以开发新的生防菌剂，为进一步研究利用抑菌活性物质奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 根际土样

枸骨根际土样采自云南省曲靖市会泽县，为枸骨根系周围表层下的土壤.采集方法：将其表层杂物清除掉，挖取深度为 20 cm 耕作层的根际土壤.

1.1.2 供试病原指示菌

抑菌活性检测所用的17种病原指示菌分别为8种革兰氏阴性菌、8种革兰氏阳性菌和1种病原真菌(酵母菌).其类别与来源详见表1.

表1 试验用病原指示菌

1.1.3 培养基和培养条件

根际土壤放线菌分离、纯化和形态观察使用的培养基为改良高氏一号培养基(制作流程：在可溶性淀粉 20 g、硝酸钾 1 g、磷酸二氢钾 0.5 g、硫酸镁 0.5 g、氯化钠 0.5 g、硫酸亚铁 0.01 g、琼脂 15 g 中加入蒸馏水至 1 000 mL，调节pH=7.2～7.4后，经 121 ℃ 高压灭菌 15 min 后冷却得到培养液.当冷却至50～55 ℃ 时，在 300 mL 培养液中加入3%的重铬酸钾 1 mL 混匀，最后倒入无菌平皿)，分离培养温度为 28 ℃；菌株纯化后，培养温度为 30 ℃.种子培养基为TSB培养基即蛋白胨大豆肉汤培养基(制作流程：在胰蛋白胨大豆肉汤 30 g 中加蒸馏水至 1 000 mL，分装至锥形瓶中，121 ℃ 高压灭菌 15 min).发酵所用培养基为自配培养基(所含物质的质量分数为：葡萄糖6%、大豆粉1.5%、硫酸铵0.5%、蛋白胨0.5%、碳酸钙0.5%、硫酸镁0.05%、硫酸二氢钾0.02%，调节pH=6.5)，液体摇床发酵温度为 30 ℃.

病原酵母菌培养采用酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基(所含物质的质量分数为：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、琼脂粉2%).病原指示细菌培养用牛肉膏蛋白胨培养基(制作流程：在牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化钠 5 g、琼脂 20 g 中加蒸馏水至 1 000 mL，其中牛肉膏用玻棒挑取，放在小烧杯中称量，用热水溶化后倒入烧杯，调节pH=7.4～7.6后，经 121 ℃ 高压灭菌 15 min 后，倒入无菌平皿).病原指示细菌和病原指示酵母菌培养温度均为 37 ℃.

1.1.4 试验试剂

试验中所用重铬酸钾溶于蒸馏水，配制成3%的重铬酸钾水溶液.蛋白酶K(20 mg/mL)，DNA连接酶(5 U/μL)，溶菌酶(50 mg/mL)等均购自Sigma公司；Taq酶及试验中所用培养基组分、各类生化试剂等均购自昆明硕阳科技有限公司.

1.1.5 引物

扩增所用引物为细菌的 16S rDNA 通用引物(由北京百泰克公司合成)：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) ；1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′).

1.2 方法

1.2.1 根际放线菌的分离、纯化

称取研细、自然风干的土样 10 g，加入含 90 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶中，160 r/min 摇床振荡 20 min，静置后制备成土壤悬液.用10倍稀释法将土壤悬液配制成10-1，10-2，10-3这3个质量浓度梯度的土壤悬液.然后，吸取每个质量浓度梯度的土壤悬液各 100 μL 分别涂布于单个改良高氏一号平皿上，每个平皿重复涂布3次，在 30 ℃ 环境下培养5～7 d.经多次纯化后，挑取单菌落到改良高氏一号试管斜面上培养，并对菌株进行编号，4 ℃ 环境下保存备用.

1.2.2 抑菌活性检测

1)次生代谢产物粗提物的制备：首先，将分离得到的放线菌单菌落接种到 20 mL 改良高氏一号液体培养基中，在 30 ℃ 环境下，200 r/min 摇床培养3～5 d.然后，按10%接种量接种到发酵培养基中，继续在 30 ℃ 环境下，200 r/min 摇床培养 5 d.最后，在得到的发酵液中加入等体积的乙酸乙酯，浸提 24 h 后过滤除去菌体，并将发酵液浓缩至 2 mL，制备成次生代谢产物粗提物.

2)指示菌的培养：挑取病原指示细菌、病原指示酵母菌单菌落分别接种到牛肉膏蛋白胨、YPD培养基中，在 37 ℃ 环境下，200 r/min 摇床培养 1 d，制成指示菌悬液.

3)含菌平板的制备：无菌条件下分别提取各种供试指示菌悬液各 0.2 mL，置于相应的牛肉膏蛋白胨、YPD固体培养基中制成含菌平板.

4)抑菌试验检测：采用滤纸片法(直径 6 mm)测定抗菌活性.首先，将浸泡于根际放线菌浓缩后发酵液的无菌滤纸片三片叠加，干燥后放入含菌平板上，每个样品重复3次，设置乙酸乙酯液为发酵液的空白对照.然后将上述样品置于 37 ℃ 环境中培养 24 h.最后，使用十字交叉法分别测量抑菌圈的直径大小.

1.2.3 抑菌活性菌株的分类鉴定

1)形态鉴定.在改良高氏一号培养基上接种并插片，30 ℃ 环境下培养.从第二天开始在显微镜下观察菌丝生长情况及孢子链形态等特征，所用显微镜型号为奥林巴斯bx43，观察时所用目镜为10×，物镜为100×，放大倍数 1 000 倍，进行初步鉴定.

2)分子鉴定.(a)枸骨根际放线菌基因组DNA的提取：采用改良高氏一号培养基液体，30 ℃ 环境下，200 r/min 摇床培养3～5 d，然后使用盐析法[23]提取DNA.(b)16S rDNA的PCR扩增条件和程序以及PCR产物的克隆参照文献[24]进行.首先采用BLAST和DNAMAN序列分析软件进行序列一致性分析.在GenBank中进行同源序列搜索，并调出相关菌株的16S rDNA序列，然后用Clustal X软件进行多序列比对，最后使用MEGA 7软件，并采用Neighbor-Joining法模型构建系统进化发育树.

2 结果与分析

2.1 根际土壤放线菌分离、纯化结果

根据菌株培养特征的不同，排除重复菌株，选择代表菌株.从枸骨根部土壤中共分离出2株放线菌菌株，分别将其命名为ZY-1和ZY-2.抑菌活性检测结果表明，只有菌株ZY-2具有较为明显的抑菌活性.

2.2 放线菌ZY-2的抑菌活性检测结果

在 120 mL 根际放线菌ZY-2的发酵液中加入等体积的乙酸乙酯，静置 1 d 后过滤除去菌体，并旋蒸浓缩成 2 mL 乙酸乙酯发酵粗提物.采用滤纸片扩散法检测其抑菌活性，见表2.结果表明，除了对耻垢分枝杆菌无明显抑菌活性，ZY-2的乙酸乙酯提液对17种病原指示菌中的16种均具有抑制效果，抑菌圈直径都在 9 mm 以上.说明其抑菌活性较为明显，具有广谱抗菌活性.

表2 菌株ZY-2抑菌活性检测结果

2.3 放线菌ZY-2的形态鉴定结果

在改良高氏一号培养基上划线培养菌株ZY-2，3 d 后观察菌落正面形态(图1).结果显示,其单菌落呈皱褶状，菌落正面颜色由初期的纯白色慢慢变成淡黄色.菌株菌丝体和孢子观察结果见图2.由图2可见，菌株初期菌丝体有分枝，菌丝间无横膈膜，且不产生孢子，颜色浅而透明.随着菌株生长，菌丝体逐渐分化为营养菌丝和气生菌丝.菌株成熟后形成孢子丝，并产生大量孢子.孢子呈卵圆形、圆柱状或杆状，孢子链长，且有波状弯曲.参照《链霉菌鉴定手册》[25]，上述特征符合链霉菌特征，因此可初步认定菌株ZY-2属于放线菌门链霉菌属.

图1 菌株ZY-2培养3 d的菌落正面图

(a)插片2 d后观察的营养菌丝 (b)插片2 d后观察的气生菌丝 (c)插片3 d后观察的气生菌丝和孢子丝

(d)插片3 d后观察的孢子丝 (e)插片4 d后观察的孢子链和孢子

2.4 系统进化发育分析结果

采用盐析法提取菌株ZY-2的基因组DNA.经PCR扩增 16S rDNA 基因片段，得到了 1 500 bp 左右的条带.然后将扩增出的菌株ZY-2 16S rDNA片段胶纯化、克隆、抽提质粒并双向测序.而后将所得到的基因序列在GenBank中进行BLAST比对，选用大肠杆菌Escherichia coli ATCC 25922 MW029931作为外类群，构建系统系统发育树(图3).16S rDNA序列的结果分析显示,菌株ZY-2与细黄链霉菌Streptomyces microflavus NRRL B-1332 EF178673聚在同一分支，序列同源性为100%.结合形态特征的相似性，可将菌株ZY-2鉴定为链霉菌属细黄链霉菌.

图3 邻接法构建菌株ZY-2及相关菌株16S rDNA序列的系统发育树

3 讨论与结论

3.1 讨论

链霉菌是抗生素和其他生物活性物质的主要来源，在目前已经发现的 1 000 多种微生物产生的活性物质中，约2/3是从链霉菌属的次生代谢产物中得到的[26].且已有实验[27-30]证明，细黄链霉菌次生代谢产物对多种植物病害真菌、细菌具有广谱抑制作用.此外，细黄链霉菌还能在植物生长过程中表现出不同程度的促进生长和生物防治的作用[31-32].单一使用细黄链霉菌或配合其他微生物菌剂可制作具有生防效应的微生态肥料，此类肥料在植物病害防治等农业领域具有非常广阔的应用前景[33].尤其是在当前传统化肥、化学农药大量使用而造成生态环境日趋恶化的情况下，利用链霉菌等颇具生防与生态价值的菌种资源开发出用于防治植物病虫害、改善土壤微环境的新产品显得尤为重要.

3.2 结论

采用枸骨根际土壤悬液分离、纯化到了1株根际放线菌ZY-2.使用纸片扩散法检测其发酵产物的抑菌活性结果表明，除了对耻垢分枝杆菌无明显抑菌活性外，该菌种对所测试的其他16种病原指示菌均表现出明显的抑制效果，有广谱抗菌活性.形态特征结合 16S rDNA 系统进化分析结果表明，该根际放线菌ZY-2为链霉菌属细黄链霉菌.