老年血液透析患者血清miR-21与T细胞相关

王 珊，杨华昱，孙 颖，马 清

(首都医科大学附属北京友谊医院 老年医学科， 北京 100050)

随着老龄化社会的到来，进展到尿毒症的老年慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患者逐步增多。血液透析是治疗尿毒症的有效手段，近来有研究表明，维持性血液透析(maintenance hemodialy-sis，MHD)可以清除尿毒症患者体内大部分毒素，但血液透析本身却刺激氧化应激和诱发微炎性反应(microinflammation)状态[1]，最终增加心血管疾病、感染的患病率和癌症风险[2]。在研究中发现，MHD患者较健康人群存在明显的免疫功能障碍，出现单核细胞的促炎表型[3]、CD4+/CD8+细胞比例倒置等情况，从而增加发生脓毒症的概率[4-5]。MicroRNAs(miRNAs)是一种小的非编码RNA，主要通过结合至靶mRNA从而抑制蛋白翻译或促进mRNA降解来调控基因的转录后表达[6]。研究发现血清miRNAs是免疫系统的重要调节因子，可以调控免疫细胞中相关基因的变化，从而调控体内稳态的变化[7]。老年MHD患者出现致命性感染性疾病的可能性更大，但关于老年MDH患者微炎性反应、体内免疫功能情况和miRNAs之间相关性的研究较少，为进一步探讨老年MDH患者的免疫功能和miRNAs谱的变化，本研究除常规检测患者的外周血T淋巴细胞亚群情况、炎性指标与miRNAs的变化情况，还分析了老年MDH患者透析前后CD4+和Treg细胞百分率、miR-21相对表达量之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：本研究中的观察组为2020年1月至2021年1月在北京友谊医院老年医学科血液透析室就诊的28例老年MDH患者。纳入标准：1)年龄≥65岁；2)于北京友谊医院进行规律血液透析时间长于1年。排除标准：1)存在急性感染、外科创伤等急性疾病；2)存在肝功能衰竭、恶性肿瘤晚期、血液病等疾病。以上患者的平均透析时间为(4.3±2.6)年。在“透析前后血清miR-21表达水平与CD4+、Treg 及Treg/CD4+的相关性分析”研究部分，收集了观察组中21例患者透析前后的血液样本，另7例患者未采集透析后血液样本。

同时，选取2020年1月至2021年1月在北京友谊医院老年医学科体检进行健康体检的65岁以上老年人群作为对照组，共有47例。排除标准：1)存在3期及以上分期的CKD；2)曾进行肾切除，或患有肾小球肾炎、IgA肾病等肾脏疾病；3)存在急性感染、外科创伤等急性疾病；4)存在肝功能衰竭、恶性肿瘤晚期、血液病等疾病。本文研究通过北京市友谊医院伦理委员会批准(审批文号：2022-P2-120-01)，本研究程序均符合医院伦理委员会制订的伦理学标准。

1.1.2 试剂：Trizol试剂、miRNAs及对照引物序列(Invitrogen公司)，引物序列见表1；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒(Transgene公司)；SYBR预混试剂(TaKaRa公司)； miRcute Plus miRNA定量PCR检测试剂盒(天根生化科技有限公司SYBR®Green)；人淋巴细胞分离液(达科为公司优达®)；CD3、CD4、CD8、CD56、CD16、CD25、CD127 (IL-7Rα)抗体(Biolegend公司)；流式细胞仪(赛默飞公司Attune®NxT流式细胞仪)。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification

1.2 方法

1.2.1 治疗方法：入组的MHD患者均应用德国费森血液透析机(型号4008S)进行常规血液透析治疗，频率为每次4 h，每周3次。血液透析过程所用滤器为FX80高通量透析器(型号4008S)，透析膜表面积为1.8 m2，超滤系数40 mL/(h×mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)，血流速在200～250 mL/min，透析液流量500～700 mL/min。

1.2.2 标本采集和指标检测：本研究中MHD组患者在血液透析治疗前和治疗结束时采集血样，对照组均在入组后当天或次日空腹时采集血样。 之后在本院化验室测定血常规、血糖、肝肾功能、C反应蛋白(CRP，C-reactionprotein)、白介素-6(IL-6，interleukin-6)等实验室资料[8]。

1.2.3 外周血T淋巴细胞检测：MHD组和对照组采样时间同前，采集外周血3～4 mL，加入等体积淋巴细胞分离液、1×PBS，离心30 min后吸取白膜层，用1×PBS重复洗涤2次后制成1×107个/mL单个核细胞的混悬液，每个样本各取100 μL分别放入两个试管，加入5 μL Human TruStain FcX抗体孵育10 min，之后分别加入相应表面抗体各2 μL[即CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、CD16+抗体，或CD3+、CD4+、CD25+、CD127(IL-7Rα)抗体]混匀后避光孵育20 min，离心洗涤细胞后加入500 μL 2%多聚甲醛重悬染色细胞并室温静置20 min后上机检测。之后利用Attune® NxT流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+、CD3-CD56+CD16+自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)、CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(regulatory T cells, Treg细胞)，所有操作步骤严格按照说明书执行。

1.2.4 反转录和实时定量PCR：抽取两组人群外周血5 mL，分离血清，先用Trizol试剂提取总RNA，然后利用cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒进行反转录，使用SYBR预混试剂及ABI7500定量PCR仪进行定量PCR扩增，以人snRNA U6 (human snRNA U6)为内参，PCR引物序列见表1。采用2-△△Ct的方法对实时定量PCR的结果进行分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，应用均数±标准差(x±s)表示计量资料数据，采用t检验进行两组间比较；计数资料用率表示，采用χ2检验进行组间比较，利用Pearson相关分析比较两种参数之间的相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

分析观察组和对照组的基线资料，可看出两组人群在年龄上无统计学差异，血液透析患者的收缩压较对照组明显增高，血红蛋白、谷丙转氨酶、白蛋白水平均偏低(P<0.001)，而估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)明显偏低，尿素氮水平明显增高(P<0.001)，差异具有统计学意义(表2)。

表2 观察组和对照组的基本情况Table 2 Characteristics between observation group and the control group(x±s)

2.2 老年MHD患者外周血淋巴细胞亚群比例、炎性指标和miRNAs相对表达量

老年MHD患者透析前的CD4+淋巴细胞和Treg细胞的百分比较对照组明显增高(P<0.001)， 中性粒细胞百分比、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、C反应蛋白(C-reactionprotein，CRP)等炎性指标也较对照组明显增高(P<0.001)。同时，老年MHD患者透析前miR-21-5p的相对表达量较对照组有所增高(P<0.05)(表3)。

表3 观察组和对照组外周血T淋巴细胞亚群比例以及炎性指标、miRNAs表达量比较Table 3 Percentage of T lymphocyte subsets, and expres-sion of inflammatory indicators and miRNAs in peripheral blood between observation group and control group

2.3 老年MHD患者透析前后miR-21相对表达量、Treg细胞和CD4+淋巴细胞比率的变化

收集观察组中21例患者透析前后的血液样本，发现血液透析后eGFR、尿素氮、血磷、血钾水平明显下降(P<0.001)，血钙水平有所增高(P<0.001)。尿素下降率(urea reduction ratio，URR)的中位数为72.3(68.1，74.2)，尿素清除指数(Kt/V)的中位数为1.32(1.25，1.41)，透析充分性良好。透析后miR-21相对表达量和Treg细胞的比率均有所增高(P<0.05)(表4)。

表4 血液透析前及血液透析后MHD患者一般情况变化Table 4 Characteristics of the MHD patients before and after dialysis

2.4 老年MHD患者透析前后血清miR-21表达水平与CD4+、Treg 及Treg/CD4+的相关性分析

利用Pearson相关分析老年MHD患者透析前和透析后血清miR-21相关表达量，分别与外周血CD4+、Treg细胞比率之间的相关性，发现血清miR-21相关表达量在透析后与CD4+淋巴细胞比率呈正相关(相关系数r=0.867，P=0.039)。而透析前后血清miR-21相关表达量均与Treg细胞比率呈正相关(血液透析前r=0.5，P=0.021，血液透析后r=0.532，P=0.015)(P<0.05)，均具有统计学意义，且透析后两者相关性更加显著(表5)。

表5 血液透析前后miR-21相对表达量以及CD4+、Treg细胞比率比较Table 5 Expression of miR-21 and percentage of CD4+ and Treg cell in peripheral blood before and after dialysis

3 讨论

流行病学调查报告显示中国CKD患病率高达10.8%[9]，而老年人CKD的患病率可高达23.4%～35.8%[10]。老年CKD患者进展至终末期肾病的发病率也逐渐增高，目前已成为一项严重的社会公共卫生问题。血液透析可有效清除体内毒素和调节电解质紊乱。随着血液透析方式的不断更新，MHD患者长期存活率明显增加，也加大了老年MHD患者数量和比例，但随之而来的微炎性反应状态诱发的致命性感染疾病比例逐步增多，严重影响预后。因此，如何评估老年MHD患者的炎性反应状态和免疫功能情况显得尤为重要。

既往多项研究显示终末期肾病患者存在免疫功能紊乱，认为与尿毒症血清中较高水平的促炎细胞因子有关，当血液在透析膜中流动时会引起以中性粒细胞和单核细胞募集为特征的异物反应，从而释放促炎细胞因子，导致机体长期处于微炎性反应状态，主要体现在IL-6、TNF-α及CRP水平明显增高[11]。本研究结果显示老年MHD患者的中性粒细胞百分比、IL-6、CRP明显增高，且存在血红蛋白、白蛋白水平下降，均提示存在微炎性反应状态，有营养不良风险。Treg细胞是免疫稳态的重要贡献者，其调节失调可导致免疫耐受丧失和自身免疫性疾病。本研究发现入组的老年MHD患者透析前CD4+T细胞和Treg细胞的百分比率较对照组明显增高，说明老年MHD患者体内存在微炎性反应状态，从而刺激CD4+细胞和调节性T细胞的生成。对老年MHD患者的透析前后血样进行比对发现，入组的老年MHD患者透析充分性良好，Treg细胞比率有所增加，说明经血液透析后患者免疫功能略有恢复。

有研究发现血液透析后血清中miR-499、miR-21-5p、miR-210等相对表达量上调[12]。本研究揭示老年MHD患者透析前miR-21-5p相对表达量较对照组增高，且透析后miR-21-5p的相对表达量有所上调，这与既往研究相同。既往多个研究发现，miR-21-5p表达上调促使白细胞数量增加，同时引起TNF-α、IL-6等炎性因子的释放[13]。本研究发现透析前后miR-21表达量与Treg细胞比率呈正相关，推测miR-21-5p表达上调可引起Treg细胞的增多，进一步支持miRNAs参与血液透析过程中免疫功能的调节，这可能为利用miRNAs评估老年MHD微炎性反应状态和免疫功能情况提供新的方向。