榆栀止血颗粒减轻宫腔粘连大鼠子宫内膜纤维化

姜艳玲，丁 丽，李发余，解世雷，张一琼

(1.中药制药共性技术国家重点实验室, 山东 临沂 276006； 2.山东省日照市人民医院 妇科, 山东 日照 276826；3.南昌大学第一附属医院 妇产科, 江西 南昌 330006)

宫腔粘连(intrauterine adhesion，IUA)又称为Asheman综合征，是子宫内膜损伤，修复系统失衡，从而引起宫腔形态异常而发生的纤维化病变[1]。目前，宫腔镜宫腔粘连分离术(transcervical resection of adhesion，TCRA)是临床上治疗IUA的主要治疗方法，但治疗后再黏率高，治疗效果不够理想[2]。因此，寻找一种能有效促进子宫内膜修复的药物，是临床治疗上急需解决的问题之一。骨髓干细胞(bone marrow stem cell，BMSC)被假设为子宫内膜再生和修复的重要细胞，但其机制尚未被详细报道[3]。多项证据表明基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)/CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)轴在骨髓间充质干细胞归位过程中起着至关重要的作用[4]。已有研究证明，能够通过SDF-1/CXCR4信号通路有效促进BMSC的增殖和迁移[5]。榆栀止血颗粒为妇科疾病用药，根据中医学整体观念及遵循辨证与辨病相结合的原则，本研究建立IUA模型大鼠，拟探讨榆栀止血颗粒是否可用于治疗宫腔粘连，并初步分析其作用机制。遵循辨证与辨病相结合的原则。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SD大鼠，雌性，SPF级，体质量200 g左右[河南省动物实验中心，动物许可证号SCXK(豫)2017-0001]。

1.1.2 主要试剂：榆栀止血颗粒(国药准字Z20130019，山东新时代药业有限公司)，0.9%的氯化钠溶液溶解稀释用于研究。蛋白提取试剂盒、伊红-苏木精试剂盒、Masson染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；SDF-1抗体、CXCR4、β-actin抗体及辣根过氧化物酶结合的二抗(兔抗羊)(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：参照文献[6]，用机械刺激加脂多糖双重刺激制备大鼠IUA模型。假手术组大鼠仅做切口，不刮宫。将大鼠随机分成假手术组、模型组、榆栀止血颗粒低(30 mg/kg)、中(60 mg/kg)和高剂量组(120 mg/kg)，灌胃体积每天1次为10 mL/kg。

1.2.2 样本采集：末次给药24 h后，将大鼠麻醉，经腹主动脉取血，离心取上清，置于-80 ℃冰箱中保存备用。处死后，取各组大鼠子宫组织，肉眼观察。取大鼠同一侧子宫组织置于10%中性甲醛固定液中固定，另一侧子宫组织置于液氮中保存。

1.2.3 试剂盒检测血清炎性因子等：按照试剂盒说明书操作，检测各组大鼠血清白介素6(IL-6)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，转化生长因子β1(TGF-β1)水平。

1.2.4 HE及Masson染色检测子宫内膜腺体数量及纤维化程度：将固定24 h后的子宫组织，制成石蜡切片，进行HE染色及Masson染色。HE染色标本用于子宫内膜腺体计数。Masson染色标本用于子宫内膜纤维化面积比的计算[7]。

1.2.5 Western blot检测大鼠子宫组织SDF-1、CXCR4蛋白表达：取出液氮中保存的子宫组织，制备组织匀浆，提取总蛋白，分析各组大鼠子宫组织中SDF-1、CXCR4蛋白的表达情况，以β-actin蛋白为内参进行蛋白定量分析。

1.3 统计学分析

本研究采用SPSS 22.0软件统计分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，方法采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，采用SNK-q检验进一步两两比较。

2 结果

2.1 大鼠子宫组织大体形态学的观察

假手术组大鼠子宫大小正常，表面光滑呈淡粉色，双侧子宫粗细均匀，大小相近，有弹性。模型组大鼠子宫水肿明显，呈白色略透明，子宫两侧粗细不均，弹性减退。榆栀止血颗粒低剂量组较模型组纤细，颜色大致正常，粗细尚均匀，弹性稍差，表面有少量充血点；榆栀止血颗粒中剂量组子宫粗细较均匀，轻微水肿，表面光滑，组织有弹性；榆栀止血颗粒高剂量组子宫粗细均匀，大小正常，表面光滑，组织弹性良好。

2.2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平

与假手术组相比，模型组血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比，榆栀止血颗粒各组处理后，血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平显著降低且呈剂量依赖性(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平Table 1 Serum IL-6, TNF-α, TGF-β1 levels of rats in each group(x±s, pg/mL, n=10)

2.3 各组大鼠子宫组织病理形态表现

假手术组大鼠子宫内膜完整，腺体分布均匀。模型组子宫内膜变薄，腺体排列稀疏，可见大量炎性细胞浸润。与模型组相比，榆栀止血颗粒各组的子宫内膜增厚，炎性细胞浸润减少(图1)。

假手术组大鼠子宫内膜间质大小均匀，排列整齐；模型组大鼠子宫腔变小，胶原纤维呈条索状且排列紧密；与模型组相比，榆栀止血颗粒各组大鼠子宫腔明显增大，胶原纤维分布稀疏(图2)。

2.4 HE染色观察各组大鼠子宫内膜腺体数量和间质纤维化程度

与假手术组相比，模型组和榆栀止血颗粒各组大鼠子宫内膜腺体数均减少(P<0.05)，纤维化面积比率均增大(P<0.05)；与模型组相比，榆栀止血颗粒各组大鼠子宫内膜腺体数增加(P<0.05)，纤维化面积比率减小(P<0.05)，且均呈剂量依赖性(表2)。

A.sham operation group; B.model group; C.YZ-L group; D.YZ-M group; E.YZ-H group图1 各组大鼠子宫HE染色Fig 1 HE staining of rat uterus in each group(×100)

A.sham operation group; B.model group; C.YZ-L group; D.YZ-M group; E.YZ-H group图2 各组大鼠子宫Masson染色Fig 2 Masson staining of rat uterus in each group(×100)

表2 大鼠子宫内膜腺体数和间质纤维化面积比率Table 2 Rat endometrial gland number and interstitial fibrosis area ratio(x±s, n=10)

2.5 大鼠子宫组织SDF-1、CXCR4蛋白表达

与假手术组相比，模型组SDF-1蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。与模型组相比，榆栀止血颗粒处理组SDF-1蛋白相对表达量明显下降且呈剂量依赖性(P<0.05)(图3，表3)。

表3 各组大鼠子宫组织SDF-1、CXCR4蛋白表达检测结果Table 3 Test results of SDF-1 and CXCR4 protein expression in uterine tissues of rats in each group(x±s, n=10)

3 讨论

中医学认为湿、热、瘀血是宫腔粘连的主要病理基础，相当于现代医学的“炎性反应”和“纤维化”[8-9]。宫腔粘连发病机制复杂，其中炎性和纤维化的形成是宫腔粘连原因之一[10]。本研究构建IUA大鼠模型，结果显示造模大鼠子宫水肿明显， 子宫内膜变薄，腺体数量减少， 纤维组织增生， 血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平显著升高，揭示模型建立成功。

1.sham operation group; 2.model group; 3.YZ-L group; 4.YZ-M group; 5.YZ-H group图3 各组大鼠子宫组织Western检测结果Fig 3 Western test results of rat uterine tissues in each group

榆栀止血颗粒，具有清热、凉血、滋阴等作用，IUA大鼠经榆栀止血颗粒给药后，子宫轻微水肿，子宫内腺体数量增加，纤维化程度减弱，仅有少量炎性细胞，血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平显著降低且呈剂量依赖性，表明榆栀止血颗粒可治疗IUA大鼠子宫损伤，抑制炎性反应。

SDF-1是趋化细胞因子超家族的关键成员，它与干/祖细胞表面的受体CXCR4相互作用。SDF-1/CXCR4轴在细胞增殖、迁移、黏附、存活和旁分泌中发挥重要作用[11]。BMSCs是一种表达CXCR4的骨源性多功能干细胞，能够分化为细胞谱系，已被研究用于多种疾病的治疗[12-13]。过往研究发现，趋化因子SDF-1及其特殊受体CXCR4在骨髓间充质干细胞归位中起着至关重要的作用[4,14]。雌激素可能通过SDF-1/CXCR4轴参与子宫内膜异位症的形成和发展[15]。本研究结果发现，模型组大鼠子宫组织中SDF-1蛋白相对表达量升高，说明SDF-1蛋白可能增强宫腔粘连大鼠炎性反应，促进子宫纤维化增生。经榆栀止血颗粒治疗后，IUA大鼠子宫组织SDF-1蛋白表达量显著降低，且呈剂量依赖性，表明榆栀止血颗粒可下调SDF-1蛋白表达，揭示榆栀止血颗粒可能通过SDF-1/CXCR4轴减轻子宫炎性反应，修复子宫结构，延缓纤维化。

综上所述，榆栀止血颗粒可能通过抑制SDF-1/CXCR4轴，减轻大鼠宫腔粘连炎性反应，降低子宫组织纤维化，修复子宫结构，为临床治疗TCRA术后子宫修复提供了新思路，但具体机制仍需进一步研究。