秦皮甲素抑制人鼻咽癌细胞系HNE-3增殖

沈永华，汪峻峰，程泽星，冯娟娟

(扬州大学附属医院 耳鼻咽喉头颈外科，江苏 扬州 225001)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是临床常见的一种头颈部恶性肿瘤，目前采用放射治疗、化学药物等方式治疗鼻咽癌，但患者治疗后的不良反应大且易发生转移，因而寻找高效且安全的治疗药物或治疗方式成为亟待解决的问题[1]。从植物中提取的有效活性成分具有抗氧化、抗肿瘤等作用，并可通过多途径、多靶点等发挥作用，但其具体作用机制仍需进一步探究[2-4]。秦皮甲素(esculin)是从中药秦皮中提取的有效成分，其具有抗肿瘤等作用，研究表明秦皮甲素可抑制肺癌细胞增殖[5]。但秦皮甲素与鼻咽癌相关研究尚未见报道。环状RNA(circular RNA，circRNA)是由外显子和内含子选择性剪切形成的闭合环状RNA分子，其不具有5′端帽子与3′尾巴结构且不易被外切核酸酶降解，并可参与肿瘤细胞增殖、分化、迁移及侵袭等生物学行为，研究表明circ-ZNF609在鼻咽癌细胞中表达量升高，并可促进细胞增殖及转移[6]。但circ-ZNF609是否可作为鼻咽癌的治疗靶点尚未阐明。因此，本研究旨在探讨秦皮甲素是否可通过调控circ-ZNF609的表达而影响鼻咽癌细胞生物学行为，为鼻咽癌治疗药物的研发提供实验资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秦皮甲素(esculin)(中国食品药品检定研究院；批号：110756-201803)；人鼻咽癌细胞系HNE-3(上海宾穗生物科技有限公司)；荧光定量PCR试剂、Trizol试剂、反转录试剂(Thermo Fisher公司)；circ-ZNF609小分子干扰RNA(si-circ-ZNF609)及其阴性对照(si-NC)(广州市锐博生物科技有限公司)；pcDNA、circ-ZNF609过表达载体(pcDNA-circ-ZNF609)(上海吉满生物科技有限公司)；CCK-8试剂、Matrigel基质胶、丙酮酸激酶、己糖激酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；Transwell小室(Corning公司)；葡萄糖摄取检测试剂盒(AAT Bioquest公司)；兔抗人MMP-2、MMP-9与二抗(CST公司)；乳酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的处理及分组：取对数生长期HNE-3细胞按每孔5×103个/100 μL接种96孔板(100 μL/孔)，分别加入含有不同浓度秦皮甲素(0.2、0.6、1.8 mmol/L)的培养基培养24 h[7]，分别记为esculin-L组和esculin-M组、esculin-H组。同时将正常培养的HNE-3细胞记为Ctrl组。按照Lipofectamine 2000转染试剂分别将si-NC、si-circ-ZNF609转染至HNE-3细胞，分别记为si-NC组、si-circ-ZNF609组。pcDNA、pcDNA-circ-ZNF609分别转染至HNE-3细胞后加入含有1.8 mmol/L秦皮甲素的培养基培养24 h，分别记为esculin-H+pcDNA组、esculin-H+pcDNA-circ-ZNF609组。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖：消化重悬各组HNE-3细胞，按照每孔3×104个/100 μL接种96孔板，加入10 μL CCK-8试剂，培养2 h后，用酶标仪检测每孔在450 nm波长处的吸光度值(A值)并计算细胞存活率[实验组A值/对照组A值×100%]。

1.2.3 检测葡萄糖摄取水平、乳酸水平与丙酮酸激酶、己糖激酶的活性：收集各组HNE-3细胞，按照葡萄糖摄取水平检测试剂盒检测细胞葡萄糖摄取量，收集细胞培养液上清，按照乳酸水平检测试剂盒检测乳酸含量。将各组HNE-3细胞按照每孔1×104个接种于12孔板，离心后弃上清，加入1 mL提取液，应用超声波破碎细胞，8 000×g，离心10 min，收集细胞上清后采用丙酮酸激酶、己糖激酶检测试剂盒检测其活性。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞迁移与侵袭：迁移实验：首先用无血清培养基调整各组HNE-3细胞为1×105个/mL单细胞悬液。按照100 μL/孔接种上室，下室接种600 μL完全培养基，培养24 h后取出小室，用多聚甲醛固定迁移细胞20 min，0.1%结晶紫染色10 min，流水漂洗后晾干，于显微镜下计数。侵袭实验：将培养基与Matrigel基质胶按照1∶6的比例充分混匀，分别在小室的上室加入100 μL稀释液，培养箱内凝固5 h备用，后续实验步骤同迁移实验。

1.2.5 RT-qPCR检测细胞中circ-ZNF609的表达水平：用Trizol试剂分别提取各组HNE-3细胞总RNA，检测RNA浓度和纯度合格后，进行反转录合成cDNA，严格按照试剂盒说明书配置反应体系与设置反应条件进行RT-qPCR。以2-ΔΔCt法计算circ-ZNF609(以GAPDH为内参基因)相对表达量。

1.2.6 Western blot检测MMP-2、MMP-9蛋白表达量:用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，取40 μg蛋白加入样品缓冲液，混匀后置沸水浴5 min，经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉孵育2 h，分别与一抗MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)在4 ℃条件下孵育24 h，TBST洗膜后与二抗(1∶10 000)在室温下孵育1 h，凝胶成像系统拍照，应用ImageJ软件测定各条带相对灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS21.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差(x±s)表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 秦皮甲素对HNE-3细胞糖酵解增殖的影响

Esculin-L组、esculin-M组、esculin-H组细胞存活率低于Ctrl组(P<0.001)，葡萄糖摄取水平和乳酸水平低于Ctrl组(P<0.001)，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性低于Ctrl组(P<0.001)，且不同剂量组间比较差异有统计学意义(P<0.001)(表1)。

表1 秦皮甲素对HNE-3细胞增殖及糖酵解的影响Table 1 Effect of esculin on the proliferation and glycolysis of HNE-3 cells(x±s，n=9)

2.2 秦皮甲素对HNE-3细胞迁移及侵袭的影响

esculin-L组、esculin-M组、esculin-H组迁移及侵袭细胞数低于Ctrl组(P<0.001)，MMP-2、MMP-9蛋白水平低于Ctrl组(P<0.001)，且不同剂量组间比较差异有统计学意义(P<0.001)(图1，表2)。

图1 Western blot检测秦皮甲素处理对MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响Fig 1 Western blot detected effects of esculin treatment on the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins

表2 秦皮甲素对HNE-3细胞迁移及侵袭的影响Table 2 The effect of esculin on HNE-3 cell migration and invasion(x±s，n=9)

2.3 秦皮甲素对HNE-3细胞中circ-ZNF609表达量的影响

与Ctrl组比较，esculin-L组、esculin-M组、esculin-H组circ-ZNF609的表达量降低(P<0.001)，且不同剂量组间比较差异有统计学意义(P<0.001)(表3)。

表3 秦皮甲素对HNE-3细胞中circ-ZNF609表达量的影响Table 3 Effect of esculin on the expression of circ-ZNF609 in HNE-3 cells(x±s，n=9)

2.4 干扰circ-ZNF609表达对HNE-3细胞增殖、糖酵解、迁移及侵袭的影响

si-circ-ZNF609组细胞存活率低于si-NC组(P<0.001)，葡萄糖摄取水平和乳酸水平低于si-NC组(P<0.001)，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性低于si-NC组(P<0.001)，迁移及侵袭细胞数低于si-NC组(P<0.001)，MMP-2、MMP-9蛋白水平低于si-NC组(P<0.001)(图2，表4)。

表4 干扰circ-ZNF609表达对HNE-3细胞增殖、糖酵解、迁移及侵袭的影响Table 4 Effect of interference with circ-ZNF609 expression on the proliferation, glycolysis, migration and invasion of HNE-3 cells(x±s，n=9)

图2 Western blot检测干扰circ-ZNF609对MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响Fig 2 Western blot detected the effects of circ-ZNF609 interference on the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins

2.5 circ-ZNF609过表达能够推进恢复秦皮甲素对HNE-3细胞增殖、糖酵解、迁移及侵袭的抑制作用

esculin-H+pcDNA-circ-ZNF609组细胞存活率高于esculin-H+pcDNA组(P<0.001)，葡萄糖摄取水平和乳酸水平高于esculin-H+pcDNA组(P<0.001)，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性高于esculin-H+pcDNA组(P<0.001)，迁移及侵袭细胞数高于esculin-H+pcDNA组(P<0.001)，MMP-2、MMP-9蛋白水平高于esculin-H+pcDNA组(P<0.001)(图3，表5)。

表5 circ-ZNF609过表达能够恢复秦皮甲素对HNE-3细胞增殖、糖酵解、迁移及侵袭的抑制作用Table 5 Over-expression of circ-ZNF609 could restore the inhibitory effects of esculin on the proliferation, glycolysis, migration and invasion of HNE-3 cells(x±s，n=9)

图3 Western blot检测circ-ZNF609过表达联合秦皮甲素处理对MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响Fig 3 Western blot detected the effects of circ-ZNF609 over-expression combined with cetin treatment on the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins

3 讨论

秦皮甲素可能通过调控细胞周期相关通路而抑制三阴性乳腺癌细胞增殖[8]。秦皮甲素可通过抑制细胞外信号调节激酶1/2的磷酸化水平而促进肺癌细胞凋亡[9]。但秦皮甲素对鼻咽癌细胞系HNE-3生物学行为的影响尚未可知。本研究结果显示，秦皮甲素能够以浓度依赖性的方式降低HNE-3细胞存活率，提示秦皮甲素可抑制HNE-3细胞增殖。肿瘤发生发展与能量供应密切相关，糖酵解途径可供给肿瘤细胞能量，丙酮酸激酶、己糖激酶是糖酵解途径中的主要激酶，抑制丙酮酸激酶、己糖激酶活性可促进氧化磷酸化的发生从而加速癌细胞的增殖及转移[10]。本研究发现，秦皮甲素可降低HNE-3细胞葡萄糖摄取水平和乳酸水平，还可降低丙酮酸激酶和己糖激酶的活性，且呈剂量依赖性，提示秦皮甲素可抑制HNE-3细胞糖酵解从而抑制细胞增殖。MMP-2、MMP-9属于基质金属蛋白酶，其在鼻咽癌细胞中表达量升高并可促进细胞转移[11]。本研究结果显示，秦皮甲素处理后HNE-3细胞迁移及侵袭细胞数减少，MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，且呈剂量依赖性，提示秦皮甲素可抑制HNE-3细胞迁移及侵袭。但秦皮甲素调节HNE-3细胞生物学行为的分子机制尚需进一步验证。

本研究发现，秦皮甲素能够剂量依赖性地降低HNE-3细胞中circ-ZNF609的表达量，提示秦皮甲素可能通过抑制circ-ZNF609的表达而发挥抗鼻咽癌的作用。研究表明胃癌组织与细胞系中的circ-ZNF609水平升高，敲除circ-ZNF609可抑制细胞增殖及侵袭[12]。结直肠癌组织中circ-ZNF609呈高表达，抑制circ-ZNF609表达可抑制结直肠癌细胞迁移[13]。circ-ZNF609在肺腺癌组织和细胞系中表达上调，抑制其表达可抑制肺腺癌细胞增殖[14]。本研究结果显示，干扰circ-ZNF609表达后HNE-3细胞存活率降低，葡萄糖摄取水平和乳酸水平降低，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性降低，迁移及侵袭细胞数减少，而上调circ-ZNF609表达可逆转秦皮甲素对HNE-3细胞增殖、糖酵解、迁移及侵袭的抑制作用，提示秦皮甲素可通过抑制circ-ZNF609表达而抑制HNE-3细胞增殖、糖酵解、迁移及侵袭。

综上所述，秦皮甲素可抑制HNE-3细胞增殖、糖酵解、迁移及侵袭，其作用机制与抑制circ-ZNF609的表达有关，circ-ZNF609可能作为秦皮甲素治疗鼻咽癌的潜在靶点，circ-ZNF609在鼻咽癌发生发展过程中表现为癌基因的作用，可为鼻咽癌生物靶向治疗提供实验依据，还可为进一步揭示秦皮甲素治疗鼻咽癌的分子机制奠定实验基础。