正交试验优化川明参多糖超临界CO2萃取工艺

魏瑞霖，朱晨，赖朋，曾智康，段树华，陈晟

西华大学 食品与生物工程学院（成都 611730）

川明参（Chuanminshen violaceumSheh et Shan），别名明参、明沙参、土明参，是我国特有的单种属植物，为伞形科川明参属植物的干燥根，是四川道地中药材，在其主产地常被用作滋补佳品食用，具有病后补虚和强筋健骨等功效[1-4]。川明参中含有多糖、香豆素、黄酮、甾醇、蛋白质和氨基酸、有机酸、酚类等化学成分[5-10]，其中多糖类化合物是川明参中最主要成分，含量在占80%以上，已有的研究表明川明参多糖具有抗突变、镇咳、祛痰、免疫调节、抗疲劳和抗氧化等功效[11-16]，可作为医药和保健食品而被广泛运用，如何更加有效地萃取川明参多糖已成为愈加重要的问题。

目前常用的萃取川明参多糖的方法有热水浸提法和热回流法[17-18]，但这些方法在萃取过程中具有耗能大、耗时久、萃取温度高从而降低多糖活性等缺点。而超临界CO2萃取具有污染低、能耗低、耗时短、得率高、萃取温度不高、不容易引起多糖物质的变性等优点[19-21]，近几年超临界CO2萃取也被广泛地运用到植物活性物质的萃取之中，但对于川明参多糖物质的萃取还未见有其报道。

试验采用超临界CO2萃取法进行川明参多糖物质的萃取，并采用苯酚-硫酸法[22]测定其多糖含量，详细地研究了超临界CO2萃取法萃取川明参多糖的工艺条件，为川明参多糖的开发利用提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

新鲜川明参2021年由四川参巴中市购买所得，由西华大学张良副教授鉴定为伞形科川明参属植物川明参Chuanminshen viloaceumSheh et Shen.的干燥根。葡萄糖、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、石油醚（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）。

ZN-200A高速中药粉碎机（长沙市岳麓区中南制药机械厂）；TB-214型分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；HH-S4数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；SpectraMax i3x多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；Nicolet iS10近红外光谱仪（上海斯迈欧分析仪器有限公司）；HA100-50-0.5型超临界萃取装置（江苏华安科研仪器有限公司）；DHG-9035A恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器）；YR-PTB真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 川明参多糖超临界CO2萃取醇沉工艺流程

新鲜川明参→干燥→粉碎→过筛→脱脂、脱色、除小分子糖→超临界CO2萃取→旋转蒸发有机溶剂→离心→醇沉→干燥→粗多糖

1.2.2 样品预处理

将新鲜川明参清洗掉表面泥土等污垢后，置于恒温鼓风干燥箱中，于40 ℃干燥至恒重，随后运用中药粉碎器对其进行粉碎，过0.425 mm筛，除去蛋白质及小分子物质后干燥，密封于4 ℃冰箱中保存。

1.2.3 川明参多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定川明参中粗多糖含量。

1.2.3.1 标准曲线的绘制

精密称取50.0 mg于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品于50 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至50 mL，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的葡萄糖标准储备液，密封，于4 ℃冰箱中保存，备用。分别精密移取2，4，6，8，10和12 mL葡萄糖标准储备液于100 mL容量瓶中定容摇匀，配制成质量浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10和0.12 mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别吸取2 mL标准溶液于10 mL具塞试管中，迅速加入1.0 mL 5%苯酚溶液，摇匀，再小心加入5.0 mL浓硫酸，摇匀。室温下静置5 min，再水浴加热15 min，水浴温度为90 ℃。取出冷却至室温，用酶标仪在490 nm波长处测定吸光度，测量时以蒸馏水作为空白对照。以葡萄糖质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[23]。

1.2.3.2 供试品溶液的制备

采用水提醇沉法制备粗多糖，醇沉方法参考张梅等[17]，并有所改动。称取一定量预先处理的川明参粉末加入萃取罐中，运用夹带剂罐将一定浓度、料液比的无水乙醇送入萃取罐，在一定萃取压力、萃取时间、萃取温度条件下进行萃取，萃取完毕后取出，迅速采用旋转蒸发仪器将其中有机溶剂蒸出，干燥后加无水乙醇至体积分数为90%沉淀多糖，放置过夜，离心，沉淀部分用蒸馏水溶解，稀释一定倍数得川明参多糖待测液。

1.2.3.3 多糖萃取率计算

川明参多糖萃取率按式（1）计算。

式中：Y为川明参多糖萃取率，%；c为样品测定液中葡萄糖的质量浓度，mg/mL；f为稀释倍数；m为试验所取的川明参粉末质量，g。

1.2.4 夹带剂单因素试验

准确称取适量预先处理的川明参粉末，选取不同浓度夹带剂（90%乙醇，70%乙醇，50%乙醇和30%乙醇）和料液比[1∶1，1∶2，1∶3和1∶4（g/mL）]，进行单因素试验，分别考察不同条件夹带剂对超临界CO2萃取川明参多糖萃取率的影响。结果显示，初始的单因素条件分别为萃取夹带剂浓度70%乙醇，料液比1∶3（g/mL）。

1.2.5 萃取单因素试验

在上述夹带剂单因素试验结果下进行以下试验。

1.2.5.1 萃取温度

固定萃取时间1.5 h、萃取压力20 MPa，考察不同萃取温度（35，40，45和50 ℃）对川明参多糖萃取率的影响。

1.2.5.2 萃取时间

固定萃取温度40 ℃、萃取压力20 MPa，考察不同萃取时间（1，1.5，2和2.5 h）对川明参多糖萃取率的影响。

1.2.5.3 萃取压力

固定萃取温度40 ℃、萃取时间1.5 h，考察不同萃取压力（15，20，25和30 MPa）对川明参多糖萃取率的影响。

1.2.6 川明参多糖超临界CO2萃取的正交试验设计

在前面单因素试验的基础上，采用三因素三水平，按L9(33)正交设计进行川明参多糖超临界CO2萃取正交试验，各因素及水平设计如表1所示，每组试验重复3次。

表1 正交试验因素与水平

1.2.7 超临界CO2萃取次数对多糖萃取率的影响

对通过正交试验所得最佳萃取工艺进行萃取次数的试验，考察不同次数（1，2，3和4次）对川明参多糖萃取率的影响。

1.2.8 川明参多糖超临界CO2萃取与传统萃取法的比较

分别对超临界CO2萃取法、传统热浸提法进行川明参多糖的萃取率的测定，比较二者的优劣。

1.2.9 数据分析

每组单因素试验平行进行3次，取平均值，数据利用Origin 8.0进行绘图；使用SPSS 24.0数据分析软件对正交试验结果进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以葡萄糖浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标进行线性回归，得到回归方程y=9.048 57x+0.156 6，R2=0.998 13。试验结果表明，葡萄糖质量浓度在0.02～0.12 mg/mL之间与吸光度呈现良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 夹带剂单因素试验结果

2.2.1 夹带剂对川明参多糖萃取率的影响

表2显示了在不同夹带剂浓度的使用下，川明参多糖萃取率的变化情况。图2反映了不同夹带剂浓度对川明参多糖萃取率的影响趋势。可见，在夹带剂为90%乙醇时达到最佳多糖萃取率。夹带剂的加入能够与CO2流体相容，大大地提高川明参多糖在CO2流体中的溶解度，因而增加其多糖萃取率，因此，选择夹带剂90%乙醇进行后续试验考察。

表2 夹带剂对川明参多糖萃取率的影响

图2 夹带剂浓度对川明参多糖萃取率的影响

2.2.2 夹带剂料液比对川明参多糖萃取率的影响

表3显示了在不同料液比下，川明参多糖萃取率的变化情况。图3显示了料液比对多糖萃取率的影响趋势。根据图3的走势情况可以看到，随着料液比变化至1∶3（g/mL），多糖萃取率液呈线性增长，但随后多糖萃取率呈下降趋势，这可能是因为过大的液体比反而使得萃取不完全，导致多糖萃取率的降低，因此在料液比1∶3（g/mL）的条件下可取得最大多糖萃取率，所以在接下来单因素试验中选择夹带剂90%乙醇、料液比1∶3（g/mL）进行试验。

表3 料液比对川明参多糖萃取率的影响

图3 料液比对川明参多糖萃取率的影响

2.3 萃取单因素试验

根据2.2小节所得结果，在夹带剂90%乙醇、料液比1∶3（g/mL）的条件下进行如下试验。

2.3.1 萃取温度对川明参多糖萃取率的影响

表4显示了在不同萃取温度下，川明参多糖萃取率的变化情况。通过图4走势可以得到，随着萃取温度的升高，川明参多糖萃取率明显增加，在萃取温度为50 ℃时达到最大值，此时得率为21.6%。在一定温度范围内，多糖溶质分子溶出速度随着温度升高而加快，萃取率上升。当萃取温度超过45 ℃后，川明参多糖萃取率虽然仍在增加，但增加曲线斜率开始下降，这可能是温度过高导致部分多糖发生降解。因此，选择萃取温度40，45和50 ℃进行后续正交试验考察。

表4 萃取温度对川明参多糖萃取率的影响

图4 萃取温度对多糖萃取率的影响

2.3.2 萃取时间对川明参多糖萃取率的影响

表5显示了在不同萃取时间下，川明参多糖萃取率的变化情况。通过图5走势可以得到，随着萃取时间的增加，川明参多糖萃取率明显增加，在萃取时间为2 h时达到最大值，此时得率为19.98%。浸提时间超过2 h之后，多糖萃取率有所下降。这可能是因为：多糖溶解需要一定的时间才能达到平衡，在达到平衡前，随着时间的增加，多糖溶解更多，萃取率也随之增大；但在达到平衡后，多糖的溶出量基本稳定[23]，萃取率增加幅度变小，浸提时间再延长甚至可能导致多糖不稳定而发生降解，进而导致萃取率下降。因此，选择萃取时间1.5，2和2.5 h进行后续正交试验考察。

表5 萃取时间对川明参多糖萃取率的影响

图5 萃取时间对川明参多糖萃取率的影响

2.3.3 萃取压力对川明参多糖萃取率的影响

表6显示了在不同萃取压力下，川明参多糖萃取率的变化情况。通过图6走势可以得到，在一定压力范围内，随着萃取压力的升高，超临界CO2流体密度增大，溶解能力增强，从而提高了川明参多糖萃取率，不过当压力增大到一定的程度后，超临界CO2流体接近于液态流体，其密度不再随压力变化[24]，对川明参多糖萃取率影响也变小，故在压力达到30 MPa时，川明参多糖萃取率反而开始下降。另外，考虑到设备操作、生产成本和安全问题，一般也不宜将压力设置得太高。所以将试验的较适宜萃取压力定为25 MPa。因此，选择萃取压力15，20和25 MPa进行后续正交试验考察。

表6 萃取压力对川明参多糖萃取率的影响

图6 萃取压力对川明参多糖萃取率的影响

2.4 正交试验结果

正交优化试验结果如表7所示。由结果可知，所考察的3个因素中各因素对多糖萃取率的影响顺序是A＞C＞B，即萃取温度＞萃取压力＞萃取时间，其水平优劣次序分别为A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1。对正交试验结果进行方差分析，其结果见表8。从方差分析结果可以看出，A因素即萃取温度对川明参多糖萃取率具有极显著影响（P＜0.01），C因素即萃取压力对川明参粗多糖萃取率具有显著影响（P＜0.05），因素B萃取时间对川明参粗多糖萃取率影响不显著。因此直观分析结合方差分析结果确定，川明参多糖最佳萃取工艺条件为A3B2C3，即萃取温度50℃，萃取时间2 h，萃取压力25 MPa。

表7 正交试验结果

表8 方差分析结果

根据上述优化萃取条件，在最佳因素组合A3B2C3（萃取温度50 ℃，萃取时间2 h，萃取压力25 MPa）条件下进行3组平行试验，川明参粗多糖萃取率结果见表9。

表9 在A3B2C3试验条件下的多糖萃取结果

由表9验证试验结果可知，川明参多糖最佳萃取工艺条件为A3B2C3，即萃取温度50 ℃，萃取时间2 h，萃取压力25 MPa，此时川明参多糖最佳萃取率为23.81%。

2.5 超临界CO2法萃取次数对川明参多糖萃取率的影响

如图7所示，超临界CO2萃取次数达到2次时已达到基本完全萃取，考虑到经济以及时间成本，故将2次萃取定为川明参多糖最佳萃取次数。

图7 萃取次数对川明参多糖萃取率的影响

2.6 超临界CO2法与常规传统热浸提法的比较

传统热浸提法：称取一定量预处理完毕后的川明参粉末，放入烧杯中并加入1∶35（g/mL）料液比的蒸馏水，搅拌均匀后浸泡30 min后放入100 ℃水浴锅中浸提8.00 h，萃取2次，测定其川明参多糖的萃取率。将传统热浸提法结果与超临界CO2法结果相比较，结果见表10。

表10 超临界CO2萃取与传统热浸提结果

3 结论

试验通过单因素试验和正交试验，首次将超临界CO2萃取运用于川明参粗多糖的萃取试验，主要得到以下结论：

1) 设计超临界CO2萃取夹带剂选择试验，得到运用夹带剂90%乙醇，料液比1∶3（g/mL）的乙醇溶液作为萃取夹带剂可得到最佳川明参粗多糖萃取率。

2) 运用SPSS软件对试验数据进行多元线性回归分析，结果显示，在选定的水平范围内所考察的3个因素对川明参粗多糖萃取率的影响分别为萃取温度＞萃取压力＞萃取时间。通过正交试验结果表明最佳萃取工艺为萃取温度50 ℃，萃取时间2 h，萃取压力25 MPa，其中萃取温度对川明参粗多糖萃取率具有极显著影响（P＜0.01），萃取压力对川明参粗多糖萃取率具有显著影响（P＜0.05）。

3) 研究得到的萃取工艺与传统水提工艺相比，克服了后者由于高温从而容易破坏多糖分子活性、萃取时间过长等缺点，并且由于萃取系统采用CO2气体，使得对环境的污染降低，且更加节能。通过验证试验加以检验，按最优萃取工艺萃取2次的粗多糖得率为23.81%，从而证明通过研究得到的萃取工艺是稳定、可靠的。