胰腺癌组织中微血管密度和淋巴管密度对术后1年内肿瘤远处转移的预测价值

陆厚良 乔莎莎 韦有亮 陈琼

1来宾市人民医院病理科，来宾 546100 ； 2来宾市人民医院肝胆胰外科，来宾 546100

胰腺癌具有症状隐匿、手术切除率低、易复发转移等特点[1]，据报道我国45.8%～51.5%的胰腺癌患者术后1年内出现复发或转移[2]。研究发现，微血管密度(microvessel density，MVD)和淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)在肾癌和肺癌患者癌组织中增高，与肿瘤术后复发转移和不良预后相关[3-4]。但MVD、LVD与胰腺癌术后肿瘤远处转移的相关性尚未见报道。本研究探讨胰腺癌组织中的MVD和LVD对肿瘤术后1年内远处转移的预测价值，旨在为识别和筛查肿瘤转移的高危患者提供临床参考。

资料与方法

一、一般资料

回顾性分析2020年1月至2021年12月间广西来宾市人民医院收治的47例行手术治疗并经病理确诊为胰腺导管腺癌患者的临床资料，其中男性33例，女性14例，年龄42～67岁，中位年龄52岁。纳入标准：(1)均为无远处转移的胰头癌患者；(2)均行胰十二指肠切除术；(3)术后接受规律随访1年。排除标准：(1)术前接受抗肿瘤治疗；(2)术中发现胰头癌伴远处转移者；(3)既往患过其他恶性肿瘤；(4)存在严重心、肝、肾、肺基础疾病；(5)失访患者。本研究经医院伦理委员会审核批准，所有患者均签署知情同意书。

二、随访和分组

术后1年内常规每3个月复查血清学肿瘤指标，胸、腹部增强CT或MR。若有不适即随诊。随诊时怀疑肿瘤远处转移(除胰腺外的其他组织器官转移)，行穿刺活检或PET-CT明确诊断，并记录肿瘤远处转移时间。根据术后1年随访期内肿瘤是否发生远处转移分为无转移组和转移组。

三、MVD和LVD检测

分别取癌组织及其匹配的距肿瘤2 cm以上并证实无癌细胞的癌旁组织蜡块标本，4 μm 厚度连续切片，采用免疫组织化学染色法分别检测微血管上皮细胞CD34表达，淋巴管上皮细胞D2-40表达，染色步骤按照试剂盒说明书进行。CD34、D2-40即用型抗体购于福州迈新生物科技有限公司。MVD、LVD分别参照Weidner等[5]、Nakayama等[6]报道的方法计算。CD34染色阳性为血管内皮细胞膜或细胞质呈棕黄色或棕褐色着色；D2-40阳性染色定位于淋巴管内皮细胞的胞膜。染色后的切片置100倍视野下观察，排除切缘出血区域，寻找微血管或淋巴管的分布区域，然后在400倍视野下随机选取5个视野，计数CD34表达阳性血管数或D2-40表达阳性淋巴管数，取其均值作为MVD或LVD。

四、观察指标

记录患者性别、年龄、肿瘤长径、肿瘤分化程度、淋巴结转移、脉管侵犯、神经侵犯、肿瘤分期、术后化疗等指标。

五、统计学处理

结 果

一、一般资料

47例胰腺癌患者中3例术后出现胰瘘，2例出现肠瘘，经非手术治疗后均好转出院。24例(51.1%)术后1年内未发生肿瘤远处转移(无转移组)，23例(48.9%)在1年随访时间内出现肿瘤远处转移(转移组)，转移时间为3～12个月，中位时间9个月，其中14例出现肝转移，8例出现腹腔转移，1例出现肺转移。

二、胰腺癌组织和正常癌旁组织MVD、LVD

转移组和无转移组胰腺癌组织的MVD分别为(72.52±9.73)、(63.20±6.52)个/400倍视野，显著高于正常癌旁组织的(51.73±7.95)、(54.79±5.80)个/400倍视野(t值分别为9.34、7.16，P值均<0.001)；转移组和无转移组胰腺癌组织的LVD分别为(23.78±6.87)、(16.25±5.15)个/400倍视野，显著高于正常癌旁组织的(14.00±5.66)、(13.62±5.03)个/400倍视野(t值分别为8.66、5.71，P值均<0.001)；转移组胰腺癌组织的MVD和LVD分别高于无转移组癌组织的MVD和LVD(t值分别为6.75、6.99，P值均<0.001)；转移组正常癌旁组织的MVD和LVD与无转移组癌旁组织的MVD和LVD差异无统计学意义(t值分别为-1.13、0.74，P值均>0.05)。

三、胰腺癌组织MVD、LVD与临床病理特征的关系

肿瘤长径≥2 cm、淋巴结转移、脉管侵犯、TNM高分期患者癌组织的MVD较高(P<0.05，表1)；肿瘤长径≥2 cm、肿瘤中低分化、淋巴结转移、脉管侵犯、神经侵犯、TNM高分期患者癌组织的LVD较高(P<0.05，表1)。

表1 胰腺癌组织微血管密度和淋巴管密度与临床病理特征的关系(个/400倍视野，

四、MVD、LVD对胰腺癌术后1年内肿瘤远处转移的预测价值

ROC曲线分析显示，MVD对胰腺癌术后1年内肿瘤远处转移预测的临界值为70.5个/400倍视野，AUC值为0.799(95%CI=0.659～0.939)，灵敏度为73.9%，特异度为87.5%(图1A)。LVD对胰腺癌术后1年内肿瘤远处转移预测的临界值为20.5个/400倍视野，AUC值为0.803(95%CI=0.676～0.929)，灵敏度为69.6%，特异度为83.7%(图1B)。

图1 微血管密度(1A)、淋巴管密度(1B)预测胰腺癌术后1年内肿瘤远处转移的ROC曲线

五、高、低MVD组和高、低LVD组胰腺癌患者术后1年内累积肿瘤远处转移率

以MVD、LVD预测术后1年内远处转移的临界值70.5、20.5个/400倍视野为界，将患者分为高MVD组(17例)和低MVD组(30例)、高LVD组(18例)和低LVD组(29例)。高MVD组术后1年内累积肿瘤远处转移率显著高于低MVD组，差异有统计学意义(χ2=7.15、P<0.05，图2A)；高LVD组术后1年内累积肿瘤远处转移率也显著高于低LVD 组，差异有统计学意义(χ2=8.80、P=0.003，图2B)。

图2 高、低微血管密度组(2A)和淋巴管密度组(2B)患者胰腺癌术后1年内肿瘤远处转移累积率

六、胰腺癌术后1年内肿瘤远处转移的影响因素

单因素分析结果显示，肿瘤长径≥2 cm、淋巴结转移、脉管侵犯、术后无化疗、高MVD和高LVD患者术后1年内肿瘤远处转移的发生率较高(表2)。多因素分析结果显示，肿瘤长径≥2 cm、淋巴结转移、高MVD和高LVD是胰腺癌术后1年内肿瘤远处转移的独立影响因素(表3)。

表2 47例胰腺癌术后1年内肿瘤远处转移的单因素分析

表3 胰腺癌术后1年内肿瘤远处转移的多因素logistic回归分析

讨 论

胰腺癌是恶性程度极高的肿瘤，5年总体生存率仅为5%[7-8]。胰腺毗邻多处重要脏器和血管，解剖位置特殊，约50%的患者确诊时已失去手术根治性切除的机会，而手术患者中约80%术后随访中出现远处转移，胰周血管和淋巴管丰富，为肿瘤远处转移提供解剖路径。胰腺癌细胞可以通过胰周淋巴结上行至肝门淋巴结，最终发生腹腔或者肝脏转移[9]；还可以通过肠系膜上静脉回流至门静脉，发生远处转移[10]。本研究纳入47例胰腺癌患者，共有23例术后转移，其中60.9%(14/23)发生肝脏转移，34.8%(8/23)发生腹腔局部转移，4.3%(1/23)发生肺转移。

MVD是评价肿瘤中单位面积内血管数量常用指标，MVD增高提示新生血管增多。新生血管可以为肿瘤细胞恶性增殖提供大量氧气和营养物质，同时新生血管内皮细胞结构尚不完整，肿瘤细胞容易突破基底膜发生血管浸润和远处转移。研究发现MVD与肝癌、肾癌和食道癌术后转移密切相关，可以作为评估预后的指标[11-13]。LVD是指实体肿瘤组织中淋巴管分布密度，在一定程度上反应肿瘤组织毛细淋巴管的形成速度和密度，而淋巴管密度增加为肿瘤细胞发生淋巴管浸润、淋巴结转移提供有利的微环境[14]。胰头周围淋巴交通复杂，侧支循环多变，对于淋巴管微转移术前常规MR和PET-CT检查无法发现。所以淋巴管密度增加很可能是肿瘤发生淋巴结转移的前提条件。在肝癌研究中发现，LVD与患者不良病理特征和预后密切相关[15]。

本研究结果发现，胰腺癌组织MVD和LVD显著高于正常癌旁组织，随访结果显示肿瘤1年内远处转移组患者癌组织中MVD和LVD也高于无转移组患者。这提示胰腺癌患者术后发生远处转移可能与MVD和LVD有关，癌细胞可能通过微血管和淋巴管通路发生远处迁移和种植，而单位组织内MVD和LVD增高，为癌细胞远处转移创造有利条件。进一步分析胰腺癌组织中MVD和LVD与临床病理特征关系发现，肿瘤长径≥2 cm、肿瘤中低分化、淋巴结转移、脉管侵犯等患者癌组织中MVD和LVD增高。而这类病理特征被认为与胰腺癌患者不良预后密切相关[16-17]。有学者通过基础研究证实了MVD和LVD与胰腺癌远处转移的相关机制。血管生成基因CXCL 1和CXCL 8受IL-8和IL-35表达调控，刺激血管内皮细胞生成因子上调，促进血管生成，单位组织内血管密度增加，促进肿瘤远处转移[18-19]；胰腺癌组织中低氧环境促进淋巴管迷路生成，LVD增高，通过上调染色体中非编码基因BANCR表达进一步促进淋巴管生成和肿瘤细胞转移[20]。根据本研究随访结果，23例患者术后1年内发生肿瘤远处转移，MVD、LVD对术后1年内发生肿瘤远处转移有预测作用，最佳预测界值分别为70.5个/400倍视野和20.5个/400倍视野。同时高MVD和LVD也是胰腺癌术后1年内远处转移的独立危险因素。在临床上可以通过分析癌组织的MVD和LVD预测患者的预后，并根据患者个体情况制定适合的术后复查随访方案，密切跟踪随访肿瘤转移情况，为胰腺癌患者术后制定复查方案提供新的思路。

综上所述，胰腺癌组织MVD和LVD增高，是术后1年内肿瘤远处转移的独立影响因素，可用于预测患者术后1年内有无肿瘤远处转移，具有一定临床意义，但仍需大样本对照研究进一步验证。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明陆厚良：设计实验、文章撰写；乔莎莎：实验操作、数据整理、统计学分析；韦有亮：参与手术实施、数据收集；陈琼：实验设计指导、论文修改