基于液质联用和分子对接技术对薄蒴草抗炎活性成分的筛选

2022-08-27 13:54吴孟雅张楠茜张凯月吕经纬孙佳明
食品工业科技 2022年17期
关键词:芦丁黄酮类抗炎

吴孟雅,张楠茜,张凯月,吕经纬,兰 梦,张 辉,孙佳明

(长春中医药大学吉林省人参科学研究院,吉林长春 130117)

薄蒴草(Fisch. et Mey.)为石竹科薄蒴草属唯一植物,生长于我国西藏、青海、甘肃、陕西、内蒙古、新疆等地,北纬26°~34°的亚洲其他温带地区分布亦较为广泛。薄蒴草为一年生草本植物,因其遮光、吸水、吸肥的特点,在新疆哈密地区豌豆、油菜农地里被作为杂草处理,目前对其食用、药用研究仍处于起步阶段,也尚未见有对薄蒴草活性及成分的相关报道。

《中华本草》记载,薄蒴草花期可全草入药,中药名为娘娘菜,味甘,性微寒,具有清热利肺,散瘀托毒之功效,常用于治疗肺热咳嗽和痈疽疔疮。因肺热引起咳嗽的病人多有细菌或支原体感染所致的炎症反应,结合报道从生源相近的漆姑草全草中分离得到四个黄酮衍生物,并发现腹腔注射10 mg/kg 的漆姑草黄酮苷对大鼠有明显的抗炎作用,推测薄蒴草亦可能具有抗炎活性。近年来研究发现食源性黄酮类物质具有一定的抗炎活性并在调节人体健康中起着积极作用,在炎症性疾病的防治中具有广阔的应用前景。因此,从薄蒴草中寻找安全有效的天然黄酮类抗炎物质对于其野生资源的开发利用意义重大。

因激活的炎症反应能诱导多种促炎介质如一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)和前列腺素E(PGE)的过量分泌,故本文通过考察薄蒴草不同极性萃取部位对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW 264.7 产生NO、TNF-、IL-6 的影响以筛选其抗炎活性部位。目前,液质联用技术和分子对接技术已被广泛应用于植物活性成分的全面分析,本文应用HPLC-MS 对抗炎活性部位的化学成分进行分析,结合分子对接技术以小分子化学成分与激活的炎症反应中主要炎症因子TNF-、IL-6、IL-1、PGE、核转录因子-B(NF-B)进行对接,最终根据结合能筛选出薄蒴草的抗炎活性因子,为其进一步的开发应用提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

薄蒴草 甘肃中医药大学提供,长春中医药大学张辉教授鉴定为伞形科薄蒴草属薄蒴草(Fisch. et Mey.)的干燥全草;小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株RAW 264.7 中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心;胎牛血清 美国赛默飞世尔科技公司;胰蛋白酶(2500 Kat) 美国阿姆雷斯科公司;磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM 培养基、双抗(100 μg/mL 的青霉素、100 μg/mL 的链霉素) 美国海克隆公司;脂多糖(LPS) 美国西格玛奥德里奇公司;二甲基亚砜、地塞米松 北京索莱宝科技有限公司;NO 检测试剂盒 美国兰德公司;TNF-、IL-6 酶联免疫吸附检测试剂盒 美国普洛麦格公司;甲醇和乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

RRLC-QTOF/MS 高分辨快速液相四极杆飞行时间串联质谱仪 美国沃特斯公司;BSA124SCW 电子天平 德国赛多利斯公司;Milli-Q 超纯水仪 美国贝德福德公司;KS-5200DB 型清洗器 昆山洁力美超声仪器有限公司;BIO Memory-86 ℃超低温冰箱 法国涞铂锐公司;YZ-875 超净工作台苏州净化设备厂;Microfuge.22RCentrifuge 型高速低温离心机 美国贝克曼库尔特公司;多规格培养皿美国康宁公司;HERAEUS HERA cell 150 二氧化碳培养箱 日本三洋公司;THZ-C 旋转式恒温振荡器 苏州培英实验设备有限公司;Mode 1680 型酶标仪 日本宝生物工程株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 薄蒴草不同极性部位制备 取薄蒴草300 g,粉碎,置圆底烧瓶中,10 倍量70%乙醇回流提取3 次,每次1 h。合并提取液,回收乙醇,减压浓缩至无醇味。浓缩液依次用等倍量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取3 次,减压回收溶剂,干燥,得到薄蒴草石油醚部位(SYM)8.85 g、二氯甲烷部位(ELJW)0.30 g、乙酸乙酯部位(YSYZ)0.90 g、水饱和正丁醇部位(ZDC)2.82 g 和萃后水液(SY)22.14 g,备用。

1.2.2 薄蒴草抗炎活性部位筛选 本实验通过研究薄蒴草不同极性萃取部位对LPS 诱导的RAW 264.7细胞产生NO、TNF-和IL-6 的影响进行薄蒴草抗炎活性部位的筛选。首先,RAW 264.7 在37 ℃、5%CO的培养箱中常规培养于DMEM 培养基中。将RAW 264.7 细胞(1×10个/mL)接种在96 孔培养板中,在37 ℃、5% CO完全湿润的环境中孵育24 h。除空白对照组外其他组别用1 μg/mL LPS 刺激细胞,孵育24 h。以加入100 μL 含有不同浓度(25、50、75 μg/mL)的薄蒴草不同极性部位的培养基为实验组,以加入100 μL 地塞米松(100 μmol/L)为阳性对照组,空白对照组和模型对照组加入相同体积的培养基,每组设置三复孔,在培养箱中反应24 h。最后使用NO 检测试剂盒(硝酸还原酶法)测定NO 水平,使用TNF-、IL-6 酶联免疫吸附检测试剂盒测定TNF-和IL-6 的浓度。

1.2.3 薄蒴草抗炎活性部位HPLC-MS 分析 采用HPLC-MS 鉴定薄蒴草抗炎活性部位中的化学成分,样品使用甲醇溶解,浓度为1 μg/mL,设置相应参数,进样方式采用自动进样。

色谱质谱条件如下,固定相:Agilent Eclipse Plus-C色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相A 为乙腈,B 为1‰甲酸水溶液。采用二元线性梯度洗脱,洗脱条件为0~10 min:35%~60% A、65%~40% B,10~40 min:60%~85% A、40%~15% B。流速:0.6 mL/min,进样量:20 μL,柱温:30 ℃。质谱条件:采用电喷雾负离子模式;质量扫描范围:m/z 100~2200;干燥气流速:10.0 L/min;气体温度:350 ℃;雾化气压力:255 kPa;毛细管电压:3.5 kV,锥孔电压:65 V,裂解电压:150 V。检测样本前,校正质量轴。

1.2.4 分子对接 检索Pubchem 数据库(https://www.pubchem.org/),下载抗炎活性部位中化学成分的sdf 2D 结构的分子式,通过Chem 3D 软件转换为pdb格式,使用Autodock 确认可旋转的键并保存为pdbqt格式,以备后续对接使用。

通过RSCB PDB 数据库(http://www.rcsb.org/)下载重要蛋白受体的pdb 格式文件,经Pymol 对其进行去水、加氢等操作,使用Autodock 保存为pdbqt格式。通过查询文献确定重要蛋白受体的结合位点坐标及尺寸并按照相关格式保存为txt 格式。其中各靶点的box 大小均为26×26×26,盒子中心坐标分别为TNF-(2az5,-17.53,67.5,17.19)、IL-6(4cni,82.27,-33.6,-11.52)、IL-1(5r8q,48.11,5.14,75.31)、PGE(5k0i,-1.01,14.38,6.9)、NF-B(6sh6,18.2,-20.47,0.89)。抗炎活性部位中化学成分所有可旋转键均设为柔性,重要蛋白受体设置为钢性,搜寻精度exhaustiveness 设为64,格点间距1Å,其他参数默认,运行Autodock Vina 采用拉马克遗传算法对接运算100 次。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 薄蒴草抗炎活性部位筛选

薄蒴草不同极性萃取部位对LPS 诱导的RAW 264.7 细胞产生NO、TNF-和IL-6 的影响如图1所示。与空白组相比,LPS 刺激后NO、TNF-和IL-6 释放量显著增加(<0.05)。与模型组相比,薄蒴草不同极性萃取部位在不同的试验浓度下,对NO、TNF-、IL-6 的释放均有不同程度地显著抑制(<0.01,<0.05)。相比之下,乙酸乙酯部位强于其他各组,与模型组相比在最高实验浓度75 μg/mL 下对NO、TNF-、IL-6 的产生均有极显著抑制作用(<0.01),抑制率分别为63.53%、34.23%、34.58%,且随着浓度的增加,NO、TNF-、IL-6 释放量总体呈下降的趋势。这表明在试验浓度下,乙酸乙酯部位对LPS 诱导的RAW 264.7 细胞炎症状态具有缓解作用,且呈一定的剂量依赖性。实验组NO、TNF-、IL-6 释放量与阳性药物组无显著差异(>0.05),该结果表明薄蒴草不同极性部位在25~75 μg/mL 的浓度下具有良好的抗炎效果。

Fig.1 The effect of Lepyrodiclis holosteoides extractions on LPS-induced production of NO, TNF-α and IL-6 in RAW 264.7 cells

2.2 薄蒴草抗炎活性部位HPLC-MS 分析

取“1.2.1”项中薄蒴草抗炎活性部位样品0.1 mg溶于10.0 mL 甲醇,过0.45 μm 有机膜,经HPLC-ESIMS/MS 分析,得质谱总离子流图(图2)。

图2 薄蒴草乙酸乙酯部位中化学成分的总离子流图Fig.2 TIC chromatogram of compounds in the ethyl acetate extract of Lepyrodiclis holosteoides

依据各色谱峰的分子离子峰及主要碎片峰进行解析,其中峰10 在负离子模式下,质谱给出准分子离子峰为269.0430[M-H],推断其分子式为CHO,以m/z 269.0430 作为母离子进行二级质谱分析。所得二级质谱图中有明显的碎片离子m/z 227、185、150、133。与文献报道的芹菜素母离子裂解形成特征碎片离子一致,并与文献[12]对比,确定此化合物为芹菜素。基于以上解析过程和裂解规律,结合文献[12-18]对比,从薄蒴草抗炎活性部位指认了8 个黄酮类成分芦丁、牡荆素、山奈酚、鼠李秦素、槲皮素、芹菜素、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖苷、槲皮苷和3 个香豆素类成分伞形花内酯、7-甲氧基香豆素、5,7-二羟基香豆素,结果见表1。

表1 薄蒴草乙酸乙酯部位中化学成分的HPLC-DAD-ESI-MS2 分析Table 1 HPLC-DAD-ESI-MS2 analysis of compounds in the ethyl acetate extract of Lepyrodiclis holosteoides

2.3 分子对接

将质谱鉴定出的结构明确的11 个成分与5 个靶点,通过Autodock Vina 软件进行分子对接,通过多构象的对接结果筛选出每个靶点结合能最低的构象,使用Origin Lab 将对接结果绘制成热图(图3)。结果显示,11 个成分均可以与TNF-(2az5)、IL-6(4cni)、IL-1(5r8q)、PGE(5k0i)、NF-B(6sh6)较好地结合,且对接结果中均有优于阳性药地塞米松所对应的成分,即11 个成分具有潜在的抗炎活性。结合能结果(表2)表明5 个靶点TNF-、IL-6、IL-1、PGE、NF-B 的最佳构象的对接成分分别是槲皮苷、山奈酚、芦丁、槲皮苷、牡荆素,均是黄酮类成分。它们系通过2~3 个氢键与对应靶点活性中心的氨基酸残基相互作用而获得了较低的自由结合能。TNF-、IL-6、IL-1、PGE、NF-B 与对应成分结合能最低的构象用Pymol 程序进行可视化分析,结果见图4。

图4 槲皮苷、山奈酚、芦丁、槲皮苷、牡荆素分别与TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2、NF-κB 的分子对接模式Fig.4 Molecular docking pattern of quercetin, kaempferol, rutin, quercetin, vitexin with TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2, NF-κB main protease

表2 活性成分及阳性药与TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2、NF-κB 的结合能(kcal/mol)Table 2 Binding energies of bioactive compounds and positive drug with TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2, NF-κB (kcal/mol)

图3 对接结果Total-score 热图Fig.3 Total-score heat map of docking results

3 讨论与结论

巨噬细胞在自然免疫中起着关键作用,活化的巨噬细胞可以引发和促进多种炎症反应。炎症发生时,巨噬细胞分泌大量NO,激活NF-B 信号通路,诱导高浓度促炎细胞因子NO、TNF-和IL-6 的分泌。中和和抑制LPS 诱导的炎症介质和细胞因子已经成为预防和治疗炎症损伤的主要思想和方法之一。薄蒴草抗炎活性部位能够较好地抑制NO、TNF-和IL-6 等炎症因子的释放,说明薄蒴草具有良好的抗炎活性。经液质联用分析,从薄蒴草抗炎活性部位中分析出了8 个黄酮类成分和3 个香豆素类成分。黄酮类成分有芦丁、牡荆素、山奈酚、鼠李秦素、槲皮素、芹菜素、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖苷、槲皮苷等,香豆素类有伞形花内酯、7-甲氧基香豆素、5,7-二羟基香豆素等,其中含量较高的为芦丁和伞形花内酯。分子对接结果显示槲皮苷、山奈酚、芦丁、槲皮苷、牡荆素与TNF-、IL-6、IL-1、PGE、NF-B 等5 个重要抗炎靶点结合较好,提示黄酮类成分为薄蒴草的潜在抗炎活性物质。

近年来研究发现,芦丁是一种广泛存在于自然界多种植物中的天然黄酮类化合物,含量较为丰富,具有良好的抗炎作用。杨杰发现芦丁能够通过介导TLR4-MYD88-TRAF6-NF-B 炎症信号通路,调节细胞因子和炎症介质,发挥抗炎作用。LI 等发现牡荆素可下调炎症因子如TNF-、IL-1的表达,并改变高脂饮食小鼠肠道微生物群的组成,通过调节特定细菌的丰度来调节炎症。陈丹发现山奈酚能够有效降低CFA 造模引起的IL-6、TNF-、IL-等炎症因子的表达,减少炎症因子聚集,改善小鼠足底造模部位炎症情况。赵妍发现山奈酚能够通过抑制肺组织促炎因子NF-B、IL-1、TNF-的表达而发挥LPS 致小鼠急性肺损伤的保护效应。YANG等发现鼠李秦素能通过抑制氧化应激和炎症反应对创伤性脑损伤小鼠起到保护作用。司丽君等发现槲皮素具有良好的抗炎活性,能促进小鼠脾淋巴细胞增殖,抑制T、B 细胞增殖和细胞因子的分泌。芹菜素是一种天然黄酮类化合物,广泛分布于各种蔬菜、水果、豆科植物、茶叶等食源性植物中。大量关于芹菜素的研究表明,这种特殊的天然化合物具有潜在的抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒、提高自身免疫等多种生物活性。GAN 等发现伞形花内酯给药能有效逆转心肌梗死大鼠中TNF-、IL-6 和IL-1等炎症因子浓度的升高。唐春丽等发现从青花椒根皮中分离得到的7-甲氧基香豆素具有较强的抗NO 生成活性。

综上所述,薄蒴草抗炎活性部位中多个黄酮类成分能够抑制NO、IL-6 和TNF-等炎症因子释放以发挥其抗炎活性。因此,薄蒴草的主要抗炎功能因子为黄酮类成分,这为其在抗炎相关食品中的进一步应用和开发提供了参考。

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