2例散发型神经纤维瘤病病人及其家系NF1基因突变的检测

马盼盼 刘芙蓉 张庆华 张 钏 郝胜菊 陈 雪 王 真 孙庆梅

Ⅰ型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）的典型特征是身体多处牛奶咖啡斑，腋下和腹股沟雀斑，多个离散的皮肤神经纤维瘤以及虹膜Lisch 结 节。NF1 以 常 染 色 体 显 性 方 式 遗 传。本文报道2例散发

NF1

基因检测结果。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例1为33岁女性，眼睛周围和上身分布咖啡斑，已怀孕6周，其丈夫未见明显异常。病例2 为3 岁男孩，全身分布牛奶咖啡斑，背部皮下有一肿块，双侧扁桃体肿大，父母及其姐姐未见异常。

1.2

NF1

基因检测 抽取病例1及其丈夫、病例2及其父母外周血2～3 ml。取200 μl 外周血，采用全自动核酸提取仪提取DNA，然后使用核酸浓度测定仪NanoDrop2000 测定DNA 浓度。保证DNA 浓度在50 ng/μl 左右，OD260/280 在1.8～2.0。待测样本送至迈基诺基因检测公司进行高通量测序，平均测序深度为1 000×，所有区域达到20×以上的覆盖度。

1.3 验证

1.3.1 点突变验证分析 根据GenBank

NF1

基因序列(NC_000017.11)，应用在线Primer 3.0（http://primer3.ut.ee）软件设计相应突变位点引物。对相应致病突变位点所在基因组区域进行PCR 扩增，纯化扩增产物，使用BigDye 测序反应试剂盒（美国Applied Biosysterms公司）进行测序，然后使用ABI 3500D Genetic Analyzer仪器（美国Applied Biosysterms 公司）进行检测。最后，对测序结果与

NF1

基因参考序列（NM_000267）进行比对。1.3.2 外显子杂合缺失分析 使用多重探针连接扩增技术检测试剂盒（SALSA MLPA P081 及P082 探针，荷兰MRC 公司），包括DNA 的变性、探针杂交、连接反应、扩增、及产物分析，检测

NF1

基因拷贝数变化。

2 结果

2 例均检测出

NF1

基因突变。病例1 为

NF1

基因整体杂合缺失突变（图1A）；病例2 为

NF1

基因c.6408delA（图1B），导致氨基酸改变p.L2137Yfs*42，为移码突变，导致基因功能丧失。

图1 2例NF1基因检测结果

病例1已怀孕6周，其丈夫和胎儿进行MLPA检测，未检测到相同的致病基因突变（图2）。

图2 病例1 及其家系NF1基因检测结果

3 讨论

NF1是一种由

NF1

基因突变引起的常染色体显性遗传病。

NF1

基因跨越约350 kb的基因组DNA，包含57 个组成性外显子和3 个选择性剪接的外显子，最常见的转录本编码2 818个氨基酸多肽——神经纤维蛋白。NF1 主要是

NF1

基因的突变导致编码失活的神经纤维瘤蛋白。NF1 的诊断主要依据1988年美国国立卫生研究院制定的诊断标准，即皮肤存在牛奶咖啡斑，达到6个以上；腋窝或腹股沟雀斑；两种以上神经纤维瘤或丛状神经纤维瘤；视神经胶质瘤；虹膜错构瘤；骨骼的病灶和家族史，这7 个特征中，达到2 条或以上，可以临床诊断NF1。本文2 例均有不同程度的牛奶咖啡斑，诊断为NF1；高通量测序均检测到

NF1

基因的突变。据统计，

NF1

基因自发突变率为50%。Yao等对95 个NF1 家系进行基因检测，发现77.9%为自发突变。本文2 例NF1 通过高通量测序以及Sanger 测序和MLPA 验证，2 例均检测到

NF1

基因突变，均为自发突变，自发突变率为100%；其中1 例为

NF1

基因整体外显子缺失突变，1 例为移码突变。这与现有报道的自发突变率相差较大，可能是本文样本量过少所致，也可能是地域性差异造成的，这有待于进一步验证。另外，病例1 已怀孕6 周，我们对其丈夫进行

NF1

基因全长检测，未发现其丈夫

NF1

基因变异；随后，我们在孕18周时，进行羊水穿刺取样，通过提取羊水中胎儿DNA，进行NF1基因检测，也未发现

NF1

基因外显子缺失突变。因此，我们可以在父母明确诊断后，对胎儿进行

NF1

基因突变位点的检测，可有效避免NF1患儿出生。总之，我们进行高通量测序检测

NF1

基因变异，发现1 个新发突变位点，扩充了

NF1

基因的致病性突变位点。对胎儿进行

NF1

基因检测，可能是避免NF1患儿出生的一个措施。