传统豆酱自然发酵的过程中微生物多样性及理化性质分析

李传凤，杨安琦，王明成

(黄淮学院 生物与食品工程学院，河南 驻马店 463000)

豆酱的主要原料为大豆，通过多种曲霉发酵制成[1-2]，黄豆酱的颜色为红棕色或者红褐色，表面具有光泽，有酱香味和脂香味[3]。豆酱中富含营养物质，一类是由大豆原料组成，含有大豆中的消化酶、异黄酮、蛋白质、维生素、胆碱和胰蛋白酶等；另一类则是在发酵和加工过程中产生的肽类和类黑精等[4-5]，这些营养物质能改善和增强机体免疫功能[6-7]，极易被吸收，深受消费者的喜爱[8]。

随着社会的发展，食品的分析检测方法不断地提高，标准化生产酱类产品已经成为必然趋势。随着近年来对酱类产品研究的深入，豆酱中的生物活性功能物质不断被发现，其价值也不断被提高[9-11]。

长时间以来，采用传统加工工艺的豆酱在市场上有着主导地位，主要是由于该种方式生产豆酱需要的技术水平很低，需要的设备简单，容易操作。但是该种加工工艺也存在一定的缺陷，豆酱发酵周期长，劣质产品层出不穷[12]，很大程度上影响了豆酱的名誉，为豆酱产业的发展带来一定的阻力[13-14]。

豆酱发酵过程中微生物种类复杂，并且微生物的发酵伴随着较多的化学变化，很难清晰呈现[15]。传统的豆酱加工主要依靠环境中的微生物进行发酵，通过此方式生产豆酱需要6～10个月，使得豆酱的生产成本较高，很大程度上阻止了豆酱产业的发展[16-17]。

本研究基于此，对传统豆酱发酵过程中微生物的多样性和理化性质进行研究，旨在为今后豆酱的标准化和规模化生产提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 原材料与试剂

面粉：河南面粉厂；牛肉膏：上海生化制药厂；大豆：购于当地农贸市场；甘露糖、木糖、阿拉伯糖：Sigma公司；酵母粉：上海生化制药有限公司；胰蛋白胨：上海生物试剂有限公司；硝酸钠、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂和麦芽汁。

1.2 试验仪器

恒温培养箱、手提式压力消毒器、恒温振荡器、MP512-01型精密pH计 上海三信仪表厂。

1.3 试验方法

1.3.1 豆酱自然发酵工艺

1.3.1.1 大豆浸泡

取大豆100 kg，去杂质和泥沙，之后放入池子中浸泡，加水浸泡超过豆面5 cm，大豆浸泡10 h，直至豆酱本身的重量升高至原来的2～3倍，待豆粒膨胀无皱纹，将水放掉，滤干备用。

1.3.1.2 蒸豆

将大豆放入锅中蒸2 h，直到大豆熟透而不烂，豆子无硬心为宜。

1.3.1.3 自然发酵

把蒸熟的大豆出锅，放至80 ℃时，将75 kg面粉与大豆混合均匀，放于室内，依靠自然界中的微生物进行自然发酵。当看到豆酱表面有白色菌丝，并且有少量的淡绿色孢子，同时具有曲香味时即可。之后加入5%的盐水，混合均匀后自然晾晒，每星期翻酱2～4次，时间为90～120 d，即可制成。

1.3.2 豆酱发酵过程中微生物的分离和培养

在豆酱发酵的过程中，每个阶段进行样品采集，采用稀释涂布法，把豆酱中的微生物进行分离和培养。

1.3.3 微生物的分类及检索鉴定

根据菌落形态特征进行归类，选取单一的菌落，采用划线方式进行纯化。初步鉴定细菌的种类，根据《伯杰氏细菌系统分类学手册》、《酵母菌的特征与鉴定手册》和《真菌鉴定手册》等相关文献进行分类鉴定。

1.3.4 氨基态氮的测定

氨基态氮是由氨基和羧基构成，它们相互中和，成为中性盐，当甲醛溶液加入时，氨基和甲醛的亲和性更高，从而中和，使得溶液的羧基单独游离出来，导致溶液成为碱性，采用酸碱滴定法，测定氨基态氮含量来间接测定豆酱中氨基酸含量[18]。

1.3.5 pH值和总酸度的测定

pH值的测定：采用精密pH计其进行检测。

总酸度的测定：使用氢氧化钠标准液进行中和滴定，并以酚酞指示其滴定终点。

1.3.6 蛋白酶活力的测定

蛋白酶活力的测定：采用福林-酚试剂法[19]。

2 结果与讨论

2.1 豆酱发酵过程中酸度和pH的变化

在自然条件下，豆酱发酵过程中总酸度和pH值随着发酵时间的延长而变化，见图1。

图1 豆酱发酵过程中pH值和酸度的变化

由图1可知，发酵开始时，豆酱中的酸性物质较少，此时的豆酱pH为7，豆酱中的酸度为0。随着发酵时间的增长，豆酱中的微生物不断地繁殖和产酸，使得豆酱中的酸度快速增长。当发酵时间小于20 d时，豆酱中的酸度快速增加，随着发酵时间的延长，酸度增加的速度逐渐减缓。当发酵时间达到120 d时，豆酱中的酸度和pH值不再发生改变。

2.2 豆酱发酵过程中蛋白酶活力和氨基态氮的变化

由图2可知，随着发酵时间的增长，豆酱中的蛋白酶活为呈现先增加后降低的趋势，当发酵时间小于20 d时，豆酱中的蛋白酶活随着发酵时间的增长而快速增长。当发酵时间为20～60 d时，虽然豆酱中的蛋白酶活也在增长，但是增长的速度明显减缓。当发酵时间大于60 d时，豆酱中的蛋白酶活随着发酵时间的延长而逐渐降低。

图2 豆酱中蛋白酶活力和氨基态氮随时间的变化情况

豆酱中的氨基态氮随着发酵时间的增长而逐渐增长，当发酵时间小于20 d时，豆酱中的氨基态氮快速增长。当发酵时间大于20 d时，随着发酵时间的延长，豆酱中氨基态氮增长的速度虽然明显减缓，但还具有一定的增长幅度。

2.3 豆酱发酵过程中微生物多样性分析

在豆酱发酵的不同时间，分别对不同发酵时期的样品进行采样，对微生物的菌株进行纯化。根据分离的菌株菌落形态进行归类。不同的发酵时间，豆酱中微生物的多样性差异较大。不同时期豆酱中微生物多样性见表1。

表1 豆酱发酵的不同阶段体系中微生物的组成

由表1可知，随着发酵时间的增长，豆酱中的霉菌、酵母菌和细菌所占的比例均发生改变。但是无论是哪一种菌，都呈现出先增长后降低的趋势。这是由于发酵开始时豆酱中的环境比较适合微生物的生长，随着发酵时间的增长，豆酱中的酸度逐渐增加，整个环境不适合微生物的生长和繁殖，所以微生物的比例逐渐降低。

将豆酱发酵分为3个发酵阶段：第一阶段为第1天～第15天，第二阶段为第15天～第60天，第三阶段为第60天～第180天。

图3 豆酱发酵过程中3个阶段微生物多样性分析

在第一阶段发酵过程中，由于发酵刚刚开始，豆酱中微生物种类受环境影响明显，此时，环境中微生物种类是决定豆酱品质的关键。该阶段豆酱中的霉菌占主要优势。霉菌种类有米曲霉、酱油曲霉、高大毛霉和黑曲霉。微生物在豆酱上生长，此过程中，微生物会分泌各种蛋白酶和淀粉酶，使豆酱中的蛋白质水解成多肽和氨基酸，为后期微生物的生长发酵提供了基础。

第二阶段的发酵需要添加盐水。高盐环境和缺氧条件导致豆酱中的霉菌停止了生长，但霉菌分泌的蛋白酶和淀粉酶能够继续水解蛋白质和淀粉。同时豆酱中的乳酸菌和酵母菌快速繁殖，产生乙醇、乳酸和醋酸等产物，由于有机酸的积累，豆酱中的pH值不断下降，中性蛋白酶和碱性蛋白酶的活性逐渐被削弱。

第三阶段的发酵为豆酱的成熟阶段，豆酱中的酸性成分和酒精不断积累，导致豆酱中的微生物停止生长，但一些基本的代谢功能还保留着，随着豆酱发酵时间的不断延长，豆酱中的酸性逐渐降低，不适合微生物的生长和繁殖，微生物数量开始逐渐减少，直到趋于稳定，微生物的种类基本保持一致，此阶段是豆酱风味形成的关键阶段。

2.4 不同霉菌菌株的蛋白酶活力

蛋白酶活力是菌株质量品质的重要指标，其能力的强弱对豆酱的发酵具有重大意义，将4种菌株接种于大豆培养基上，放于室温下培养2 d，进行蛋白酶活力测定，结果见图4。

图4 不同霉菌蛋白酶活力

由图4可知，不同的霉菌的蛋白酶活力存在一定的差异。其中米曲霉和黑曲霉的蛋白酶活力更强，酱油曲霉和高大毛霉的蛋白酶活力相对较弱。如果使用蛋白酶活力较高的菌株，则可以获得风味更佳的豆酱。

3 小结

品质较高的豆酱发酵剂主要来源于风味较佳的豆酱。发酵剂的品质决定着豆酱的口感、风味和香气等感官特征[20]。所以，选择优良的发酵剂对豆酱发酵十分重要。因此，为获得品质优良的豆酱，研发豆酱发酵过程中微生物的变化至关重要。本研究通过研究豆酱发酵过程中微生物的多样性，为研究适合的人工菌种发酵豆酱奠定了基础。