蜡梅SRAP-PCR反应体系的建立

步洪凤顾振华张文斗李达

(1.常德职业技术学院，湖南 常德 415000；2.湖南农业大学风景园林与艺术设计学院，湖南 长沙 410128)

前言

蜡梅(Chimonanthus praecox)，属蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(Chimonanthus)，中国特有的落叶灌木、传统名花。自然分布区大致为长江流域中下游地区，四川东部以东，湖南吉首以北，河南伏牛山以南，东到江苏、浙江，现有天然群落仅存在于川东、重庆东北部、湘西北、鄂西北[1]。蜡梅高4～5m，成簇生长；叶对生，纸质，卵状，披针状，顶端逐渐变钝，全缘，有许多覆瓦状鳞，呈黄色，呈蜡白色[2]；花期12月—次年1月，香气浓郁；果实瘦肉多，6—7月成熟，黄似腊，香气浓郁，是一种原产于我国的珍贵冬季冷香型园林植物，在我国已经有1000多年的栽培利用历史，广泛应用于我国的园林造景中[3]。

随着分子标记技术和二代测序技术的发展，越来越多的研究人员开始使用分子标记的手段对蜡梅的遗传多样性进行研究。陈龙清等提取蜡梅2个自然群体内的21个单株样品DNA进行RAPD分析，得出蜡梅的遗传多样性主要来自群体间的差异，而单株差异较小的结论，且这一结论与形态特征是一致的[4]；赵冰等对蜡梅AFLP分子标记的反应进行探索，发现蜡梅的DNA提取可使用改良的CTAB法，而蜡梅叶片的年龄并不影响蜡梅基因组DNA提取的使用，用MseI-EcoR I酶切组合，从168对引物中筛选出10对带型分布均匀、多态性高且分辨能力强的引物，因而确定了适用于蜡梅AFLP反应的最佳酶切连接、预扩和选扩体系[5]，紧接着对我国蜡梅种质资源的7个野生自然群体进行鉴定，设计的3对引物，共扩增出了218条多态位点，占据所有位点的86.17%，种群基因分化系数为0.2906，同样也得出了蜡梅的遗传多样性主要存在于种群间，而非群体内[6]；2008年赵冰等又使用ISSR分子标记技术对蜡梅种质资源的7个野生型和2个栽培型种群的遗传多样性展开了进一步的研究，使用11条引物，扩增出110条多态位点，占据了总位点的88.70%，进一步指出了蜡梅总的遗传多样性水平较高，不同种群间的差异十分明显[7]。

为了探讨油菜品种内含子、启动子与间隔区之间存在不同长度的多态现象，2001年美国加州农学院作物系Li等根据第4代分子标记技术开发出一种特异性克隆标记方法，并将其命名为关联序列扩展多态性(Sequence-Related Anplified Polymorphism，SRAP)，该方法操作简单，结果易被重复且条带产出效率中等，具有目标片段易克隆和测序的特点[8]。在条带的产出率上介于RAPD分析与AFLP分析之间，产率中等。引物设计可以参考AFLP的方法，通过随机改变引物末端的碱基组成和排序获取新的引物，然后在原有引物上添加新的SRAP标记引物，因而不需要强调选择引物的类型。

目前该技术在甜瓜、辣椒、棉花等的研究中均显示出操作简便、稳定、产率中等、在基因组中检测位点分布均匀等特点，并在石斛属植物、水稻、番茄、黄瓜、油茶、杜鹃花属植物、烟草等植物研究中得到成功应用[9,11]，并在基因定位、图位克隆、遗传多样性研究、遗传连锁图谱、基因文库图谱、杂种优势预测、比较基因组等领域得到了广泛的应用[12]。

目前蜡梅新品种的选育主要靠播种、分株、扦插、压条、嫁接等传统的育种手段，育种周期长、劳力费时、信息量少，严重阻碍了蜡梅良种选育的进程，而SRAP能较好地克服传统育种的缺点，不易受环境的限制，可以大大缩短蜡梅的育种年限，提高育种效率[13]。本文目的在于提取高质量的适于SRAP分析的蜡梅基因组DNA，并建立和优化适于蜡梅SRAP-PCR反应的最佳实验体系，为这一技术在蜡梅种质资源上的理论与应用研究提供技术支持，从而加快鉴定、保护和合理利用我国现存的种质资源。

1 材料与方法

1.1 植物材料

2020年7月，采集常德职业技术学院资源圃的蜡梅成熟叶片为试材。

1.2 主要试剂

SDS溶液、CTAB溶液、CTAB-free溶液、初提液(CHCl3∶C5H12O=24∶1)、5mol·L-1NaAc、5mol·L-1NaCl、Tris-HCl。

1.3 主要仪器

产自美国Applied Biosystems公司的Veriti 96-well Thermal Cycler PCR扩增仪；美国Carestream Health公司的Kodak Gel Logic 212凝胶成像系统；德国Hermle公司的Z323K高速冷冻型离心机；上海双旭电子有限公司的DYY-12电泳仪、立式电泳仪；上海元析仪器有限公司的UV-2450紫外分光光度计。

1.4 方法

1.4.1 基因组DNA提取

DNA提取选择CTAB溶液为主要提取试剂，具体操作流程：在碾磨时加入少许PVP-40粉末防止材料褐化，在进行裂解前加入CTAB-free buffer洗涤蜡梅中的多糖、多酚物质，以免影响DNA质量。使用2%琼脂凝胶对提取出的DNA进行电泳检测，然后取2μL样液用无菌水稀释为100μL的体系，在Eppendorf Biophotometer上测定DNA的质量浓度(选择OD260nm/OD280nm值选项)，调节质量浓度至50ng·μL-1，-20℃保存备用。

1.4.2 PCR基本体系与扩增程序

体系为30μL的标准溶液，即150ng的模板，2.20mmol·L-1的Mg2+，1.8mmol·L-1的dNTPs，1.5mmol·L-1的引物，以及Taq酶加入量为1.8U。SRAP上游引物Me9和下游引物Em3由Invitrogen公司合成。引物序列Me9:5′-AAATTATCGATTGCAAG-3′；Em3:5′-ATGCGGTATCGATTGCAG-3′。扩增程序：在94℃进行预变性4min；94℃ 1min、35℃复性1min、72℃延长1min 5个循环；30次重复温度提高到55℃；72℃延长5min[9]。

1.4.3 单因子试验

根据表1中各影响因素水平，分别研究5个因素对SRAP-PCR反应体系的影响。电泳检测后，Goldview染色，KODAK拍照检测PCR效果。并对结果进行直观分析与评价。

表1 SRAP-PCR反应中的影响因素水平

2 单因子试验结果分析

2.1 模板浓度对SRAP-PCR结果的影响

适宜的模板含量是提高扩增保真率的基础。选择合适的模板DNA浓度对于SRAP扩增至关重要，模板量过少会使PCR产物产率过低或者得不到所需条带，但模板量过多可能会导致PCR产物中出现非特异性条带，同时还造成了DNA模板的浪费。在本试验中，设计了50ng、100ng、150ng、200ng、250ng依次递增的5个模板DNA浓度梯度。如图1所示，5个不同浓度DNA模板反应体系均得到了较为明显的条带，但高分子条带随着模板DNA量的增加引物二聚体的含量越来越高，同时高分子条带随着模板DNA浓度的增加呈现出先增高后降低的趋势，并在150ng浓度时扩增条带最多且清晰，因此本研究认为，150ng是该试验体系的最佳模板含量。

图1 模板浓度对SRAP-PCR的影响注：M为标准分子量1000bp plus；编号1～5的处理编号同表1。

2.2 Mg2+浓度对SRAP-PCR结果的影响

Mg2+是Taq酶活化的主要因素，Mg2+在反应物中的浓度对PCR的特异性及扩增效果有显著影响。其不仅会影响到酶的活性和扩增的精确度，还会产生对引物与模板的结合效果差、模板与产物的解链效率低、非特异性产物的生成以及二聚物的生成等方面的问题。因此Mg2+的含量能对SRAP产物含量产生直接的影响，Mg2+缺乏时Taq酶的活性会下降，而且dNTP还会竞争Mg2+，dNTP的浓度会进一步抑制Taq酶的活性。在本试验中，Mg2+的用量选取0.7mmol·L-1、1.0mmol·L-1、1.3mmol·L-1、1.6mmol·L-1、1.9mmol·L-1、2.2mmol·L-1、2.5mmol·L-17个梯度。如图2所示，Mg2+浓度<1.9mmol·L-1或者>2.2mmol·L-1时，扩增条带少且不清晰。考虑到Mg2+浓度过低不利于酶的激活，Mg2+浓度太高又容易产生非特异条带，因此该试验最适Mg2+浓度为2.2mmol·L-1。

图2 Mg2+浓度对SRAP-PCR的影响注：编号1～7的处理编号同表1；M为标准分子量1000bp plus。

2.3 dNTPs浓度对SRAP-PCR结果的影响

dNTPs的含量对PCR的扩增有着直接影响作用。dNTP作为PCR的反应底物，同时也会参与到Taq酶的Mg2+的争夺，所以在PCR过程中，必须将dNTP调节至适宜的水平以获得最优的扩增结果。当dNTPs的含量较低时，其扩增产物明显降低；当浓度太高时，误差增大，并与Taq酶发生竞争，导致Mg2+含量降低，导致Taq酶活力降低，PCR的反应效率下降，甚至阻碍了整个反应过程。在本试验中，dNTPs的用量选取0.6mmol·L-1、1.0mmol·L-1、1.4mmol·L-1、1.8mmol·L-1、2.2mmol·L-15个梯度。如图3所示，dNTPs的5种不同浓度含量对扩增结果影响显著，在0.6～2.2mmol·L-1，均有条带出现，0.6～1.4mmol·L-1扩展条带较1.8mmol·L-1扩增的条带数少，清晰度也较差，同时2.2mmol·L-1扩展条带较模糊，按照条带丰富稳定、清晰的原则，dNTPs适宜浓度为1.80mmol·L-1。

图3 dNTPs浓度对SRAP-PCR的影响注：M为标准分子量1000bp plus；编号1～5的处理编号同表1。

2.4 引物浓度对SRAP-PCR结果的影响

在PCR特异反应过程中，引物起着十分关键的作用，高的引物浓度将导致不特定的突变和扩增，并能提高引物间的二聚化几率；如果引入的引物质量太低，与DNA的结合效率就会下降，从而导致产物产率下降[11]。在本试验中，引物的用量选取1.0mmol·L-1、1.5mmol·L-1、2.0mmol·L-1、2.5mmol·L-1、3.0mmol·L-15个梯度。如图4所示，当引物的浓度增加时，条带亮度会出现变化，当引物的密度为1.0～3.0mmol·L-1时，条带清晰可见。基于以上条件分析，1.5mmol·L-1为最适SRAP-PCR引物浓度。

图4 引物浓度对SRAP-PCR的影响注：编号1～5的处理编号同表1；M为标准分子量1000bp plus。

2.5 Taq酶浓度对SRAP-PCR结果的影响

Taq的浓度和质量是影响基因扩增效果的关键因素。过低的Taq会使放大效率下降；而在较高浓度下，PCR的稳定性会下降，且会产生非特异的扩增区，从而产生伪阳性，即反应体系中的亮带并非扩增条带。在本试验中，Taq酶用量选取0.6U、0.8U、1.0U、1.2U、1.4U、1.6U、1.8U 7个梯度。由图5可以看出，0.6～1.8U的Taq酶均可扩增出条带，在1.4～1.8U时，随着Taq酶活性单位的增加条带亮度增加，特别以1.8U时效果最佳，故将1.8U作为最优Taq酶用量。

图5 Taq酶对SRAP-PCR的影响注：编号1～7的处理编号同表1；M为标准分子量1000bp plus。

3 结论

本试验采用CTAB洗涤法提取蜡梅成熟叶片的DNA能满足SRAP-PCR扩增的要求。单因子试验认为，SRAP-PCR的最优反应体系为150ng的模板浓度，2.20mmol·L-1的Mg2+浓度，1.8mmol·L-1的dNTPs浓度，1.5mmol·L-1的引物浓度，1.8U的Taq酶用量。

近年来，由于植物分子生物学技术的高速发展，以RAPD、AFLP、SSR及ITS为代表的分子标记技术被广泛应用于药用植物的分子鉴定和功能基因的研究。其中，RAPD技术工艺简便，但具有稳定性差、扩增产率低等缺点；AFLP技术虽具有很高的扩增产率，但其操作步骤繁琐、难以实现自动化；SSR标记具有中等产率和产物大多为共显性标记的优点，然而该标记既费时又昂贵；ITS序列分析在分子鉴别上的优点突出，但其测序资金耗费大[14]。而SRAP技术则是将RAPD与AFLP技术的优势有机地结合起来，不仅可以解决RAPD重复率低的问题，而且可以解决AFLP技术复杂、成本昂贵的问题，同时具有操作简单、快速、低成本、可靠性好、重复性好及易于测序的特点，因而很快得到了世界范围内的分子生物学研究[15]。

本实验建立了适用于蜡梅稳定可靠、重复性强的SRAP反应体系，但也不可避免地存在主观因素介入而导致的试验误差，因此，建立一套更为客观的科学评价PCR扩增结果的评价标准，将能更好地构建PCR扩增体系。