NO熏蒸调控冷藏枸杞鲜果活性氧代谢减轻褐变

王雪，李乾，刘彩红，古丽丹·塔勒达吾，刘凤兰，龙阳，王静*

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

（2.新疆林科院经济林研究所，新疆乌鲁木齐 830063）

枸杞（Lycium barbarumL.）是茄科枸杞属植物，主要分布在宁夏、新疆、内蒙古等地。目前，新疆已成为我国枸杞重点主产区[1]。枸杞具有降血糖、抗衰老、增强免疫力和保护细胞等作用，是药食两用的进补佳品[2,3]。当前干制枸杞在市场上占主要地位，但是近几年随着大众对不同口味的需求，加之精河枸杞鲜果色泽饱满、甘甜味美、营养丰富越来越受消费者青睐。然而精河县“宁杞七号”枸杞鲜果属于呼吸跃变型浆果[4]，在贮藏、运输及销售过程中，易出现褐变反应和软化的现象导致果实营养成分降低，甚至完全丧失商品价值，造成巨大的经济损失[5]。果蔬贮藏过程中的褐变反应主要是酶促褐变的底物和酶的接触反应[6]。研究报道，正常细胞中酚类物质与酚氧化酶成区域化分布。但是当植物细胞受到破坏，酚类物质则作为底物与酶接触，发生脱水缩合反应，逐渐变成黑褐色聚合物，引起果蔬褐变[7]。另有研究报道，活性氧代谢失调、自由基积累，导致植物细胞膜脂过氧化，增加有关酶类与酚类底物的接触，从而加速果实褐变[8-10]。有研究表明，冰温贮藏结合塑料盒包装可以抑制“宁杞1号”枸杞鲜果呼吸速率，提高贮藏品质[11]；马丽敏[12]发现采用酸性氧化电位水清洗、真空预冷并结合气调包装的方式可有效保持枸杞鲜果较高的商品价值，延长货架期；赵建华等[13]采用不同贮藏温度对“宁杞3号”枸杞鲜果进行研究，发现4±1 ℃贮藏通过维持枸杞活性氧代谢平衡达到延缓果实褐变的目的。但是采用NO对枸杞采后熏蒸延长其保鲜期的研究尚不多见。

有研究报道，外源NO熏蒸可以提高果蔬的抗氧化能力，延缓果蔬褐变[14]。降低采后龙眼果皮[15]、竹笋[16]、鲜切桃片[17]和鲜切板栗仁[18]的褐变度，提高贮藏品质。另有研究表明，徐福乐等[19]采用外源NO熏蒸番茄，通过降低H2O2含量和O2-·生成速率，提高SOD和CAT等相关活性氧代谢酶活力来减轻膜脂过氧化，延缓褐变进程；张政等[20]选用木纳格葡萄为试验材料，使用外源NO间歇熏蒸，提高贮藏过程中SOD、APX、CAT及POD活力，抑制H2O2和O2-·生成，维持活性氧代谢平衡，延缓果实衰老褐变；刘立芹[21]使用外源NO熏蒸鸭梨，减缓鸭梨果心褐变发生。但以枸杞鲜果为试材，采用外源NO气体熏蒸抑制枸杞鲜果褐变尚不多见。

李乾等[22]采用0、200、300 μL/L和400 μL/L的NO气体对“宁杞七号”熏蒸处理，发现300 μL/L的NO熏蒸处理对冷藏枸杞鲜果贮藏品质的保持效果较佳。因此本试验选用产自新疆博乐市的“宁杞七号”枸杞鲜果为试材，采用300 μL/L的外源NO气体熏蒸枸杞，探究经NO熏蒸后枸杞鲜果褐变和活性氧代谢的变化，以期为外源NO熏蒸在枸杞鲜果保鲜方面的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“宁杞七号”枸杞鲜果产自新疆维吾尔自治区博乐市精河县托里乡，于2019年7月3日进行人工采摘，采摘时保留果柄和萼片。在当地3±0.5 ℃冷库中预冷24 h后运送至新疆农业大学3±0.5 ℃冷库，挑选出无腐烂、发霉和遭受机械损伤的果实。将样品均分为2组，分别用0、300 μL/L NO气体（浓度为99.99%）熏蒸枸杞3 h，熏蒸后的鲜果装入带孔黄色塑料框中，每框枸杞约2 kg，体积不超过框体三分之一，置于3±0.5 ℃低温冷库贮藏，每6 d取一次样，共取样7次。

聚乙烯吡咯烷酮、曲拉通X-100、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、丙酮、浓硫酸、四氯化钛、盐酸、浓氨水、L-蛋氨酸、氮蓝四唑、核黄素、三氯乙酸、二硫代苯甲酸、抗坏血酸、氧化性谷胱甘肽、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸二钠，均为分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；愈创木酚，分析纯，天津市光复精细化工研究所；Solarbio（货号BC1108）试剂盒，Solarbio公司。

1.2 仪器与设备

PTT-A+200电子天平，福州华志科学仪器有限公司；752 N紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；D3024R冷冻离心机，上海珂淮仪器有限公司；JEA系列电子天平，上海浦春计量仪器有限公司；玻璃仪器气流烘干器，河南省予华仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 褐变度

枸杞鲜果褐变度测定参考周宏胜等[23]的方法略作改动。将20 g果肉打浆，从中称取1 g加预冷蒸馏水5 mL，低温研磨匀浆，以4000 r/min，4 ℃离心15 min，在波长410 nm处测定上清液的吸光度值A，褐变度结果以10×A表示。以上步骤重复三次。

以下所有指标测定均先取20 g果肉打浆，其余步骤按照相应参考文献进行测定。

1.3.2 过氧化氢含量和超氧阴离子生成速率

采用曹建康[24]的方法测定贮藏过程中过氧化氢（H2O2）含量的变化。

式中：

n——由标准曲线查得的溶液中过氧化氢物质的量，μmol；

V——样品提取液总体积，mL；

Vs——吸取样品液体积，mL；

m——样品质量，g。

采用曹建康[24]的方法测定枸杞贮藏过程中超氧阴离子生成速率。

式中：

n——由标准曲线查得的溶液中超氧阴离子的物质的量，μmol；

V——样品提取液总体积，mL；

Vs——吸取样品液体积，mL；

t——样品与羟胺反应的时间，min；

m——样品质量，g。

1.3.3 还原型和氧化型谷胱甘肽含量测定

还原型谷胱甘肽含量（GSH）采用曹建康[24]的方法进行测定，结果用μmoL/g FW表示。

式中：

n——由标准曲线查得的溶液中还原型GSH物质的量，μmol；

V——样品提取液总体积，mL；

Vs——吸取样品液体积，mL；

m——样品质量，g。

氧化型谷胱甘肽含量（GSSG）严格按照Solarbio（货号BC1108）试剂盒说明书步骤测定，单位µg/g。

式中：

Y——样本浓度，µg/mL；

W——样品质量，g。

1.3.4 还原型和氧化型抗坏血酸含量的测定

还原型（ASA）和氧化型抗坏血酸（DHA）含量均采用分光光度计法[24]测定。

式中：

V——样品提取液总体积，mL；

m’——由标准曲线求得的抗坏血酸的质量，μg；

Vs——滴定时所用样品提取液体积，mL；

m——样品质量，g。

1.3.5 过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活力测定

采用愈创木酚法[24]测定过氧化物酶（POD）活力，单位U=ΔOD470·g-1·min-1FW。

式中：

ΔOD470——每分钟反应混合物吸光度变化值；

V——样品提取液总体积，mL；

Δt——反应时间，min；

Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；

m——样品质量，g。

采用曹建康[24]的方法测定枸杞过氧化氢酶（CAT）活力。

式中：

ΔOD240——每分钟反应混合物吸光度变化值；

V——样品提取液总体积，mL；

Δt——反应时间，min；

Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；

m——样品质量，g。

采用曹建康[24]的方法测定枸杞超氧化物歧化酶（SOD）活力，内容稍作改动。

SOD活力测定时把日光灯下反应时间延长至40 min，其余步骤与曹建康测定方法相同。

式中：

ODC——照光对照管反应混合液的吸光度值；

ODS——样品管反应混合液的吸光度值；

V——样品提取液总体积，mL；

Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；

t——光照反应时间，min；

m——样品质量，g。

1.3.6 抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活力测定

采用曹建康[24]的方法测定枸杞鲜果贮藏过程中抗坏血酸过氧化物酶（APX）活力的变化。单位U=0.01ΔOD290·g-1·min-1FW。

式中：

ΔOD290——每分钟反应混合物吸光度变化值；

V——样品提取液总体积，mL；

Δt——反应时间，min；

Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；

m——样品质量，g。

采用曹建康[24]的方法测定枸杞鲜果在贮藏过程中谷胱甘肽还原酶（GR）活力的变化。单位U=0.01ΔOD340·g-1·min-1FW。

式中：

ΔOD340——每分钟反应混合物吸光度变化值；

V——样品提取液总体积，mL；

Δt——反应时间，min；

Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；

m——样品质量，g。

1.4 数据处理与分析

以上试验均设定3个重复，所得数据使用SPSS 19处理并进行相关性分析，由Origin 2018制图。

2 结果分析

2.1 NO熏蒸对果实褐变症状和褐变度的影响

褐变度是反映枸杞鲜果外观和品质最直观的指标。由图1可知，在整个贮藏过程中，对照组和NO处理组的枸杞鲜果褐变度均随贮藏时间的延长呈上升趋势。和对照组相比较，处理组枸杞褐变度变化较为平稳。枸杞的褐变主要表现为果面亮度降低、色泽饱满度下降、由鲜红逐渐转变成暗红色，导致褐变度增加[6]，在贮藏末期（30～36 d）对照组枸杞褐变度显著高于处理组（p＜0.01），贮藏至第36 d，对照组褐变度比处理组高27.66%。经方差分析结果表明，贮藏6 d时，对照组和处理组枸杞褐变度开始出现差异，且贮藏6 d后褐变速率加大，处理组褐变度始终显著低于对照组（p＜0.05），对照组褐变速度增加较快，这与宋康华等[25]对鲜切粉葛褐变度研究结果相似。说明NO熏蒸可以显著抑制枸杞鲜果贮藏期间褐变度的上升，且在贮藏后期降低枸杞鲜果褐变度的作用更显著。

图1 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果褐变度的影响 Fig.1 Effects of NO fumigation on the browning degree of fresh Lycium barbarum fruits during cold storage

2.2 NO熏蒸对果实H2O2含量和O2-生成速率的影响

H2O2是评价采后果蔬活性氧代谢的重要指标，H2O2含量越高，表明活性氧代谢越旺盛[26]。由图2a可以看出，自贮藏开始至结束，两组枸杞H2O2含量均呈现下降趋势，且处理组H2O2含量始终低于对照组。贮藏第6 d和第24 d时处理组与对照组枸杞鲜果中H2O2含量差异显著（p＜0.05）。谢晶等[26]发现硝普纳处理（硝普纳可以产生NO）对荔枝中H2O2含量有抑制作用，从而更好地保持荔枝的品质，延长其贮藏期。本试验研究表明NO熏蒸处理可以抑制冷藏枸杞鲜果贮藏过程中H2O2含量，减少活性氧的积累。

图2 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果H2O2含量（a）和O2-生成速率（b）的影响 Fig.2 Effect of NO fumigation on H2O2 content (a) and O2- production rate (b) of fresh Lycium barbarum fruits during cold storage

超氧阴离子是一种活性氧自由基，加速组织膜脂过氧化，促进果蔬衰老褐变。由图2b可以看出，贮藏0～30 d内两组枸杞鲜果O2-生成速率大致呈上升趋势，说明褐变加剧与活性氧的积累密切相关。除贮藏第24 d和30 d外，处理组枸杞O2-生成速率显著低于对照组（p＜0.05）；贮藏30～36 d，对照组和NO处理组枸杞O2-生成速率出现快速下降的趋势，这可能是SOD歧化反应消耗更多的O2-，故而减少了枸杞果实内O2-积累；两组果实O2-产生速率整体上呈“下降-上升-再下降”的趋势，O2-作为SOD的底物，在处理组中O2-产生速率始终低于对照组，这可能与NO能提升枸杞鲜果SOD活力有关，与谢晶等[26]对采后荔枝O2-产生速率研究结果相似。由此表明，NO熏蒸可以显著抑制枸杞鲜果贮藏期间O2-生成速率上升且在贮藏前期效果显著（p＜0.05）。

2.3 NO熏蒸对果实GSH、GSSG含量及其比值的影响

GSH可直接清除活性氧自由基或通过ASA-GSH循环达到间接清除自由基的目的[27]。由图3a可看出整个贮藏过程中两组枸杞中GSH含量整体呈现先上升后下降趋势，并且NO处理组枸杞GSH含量始终高于对照组，至贮藏结束处理组枸杞中GSH含量比对照组高32.65%（p＜0.05）。说明NO可以直接参与自由基清除的过程，NO熏蒸处理能延缓GSH的氧化消耗，维持ASA-GSH循环的稳定性与还原能力，维持枸杞鲜果的抗氧化能力。

贮藏前24 d两组枸杞鲜果中GSSG含量均呈现下降趋势（除对照组的第18 d外）；在整个贮藏过程中对照组枸杞中GSSG含量均高于处理组。贮藏第36 d，对照组枸杞GSSG含量比处理组高18.97%（图3b）。

图3 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果GSH（a）、GSSG（b）和GSH/GSSG（c）的影响 Fig.3 Effect of NO fumigation on GSH (a), GSSG content (b) and GSH/GSSG ratio (c) of fresh Lycium barbarum fruits during cold storage

GSH/GSSG可以反映枸杞鲜果氧化还原情况。如图3c所示，GSH/GSSG 变化趋势与GSH含量趋势相仿，呈现“升-降-升-降”的趋势，且整个贮藏期间处理组枸杞GSH/GSSG比值始终大于对照组，贮藏前期（6～18 d）效果显著（p＜0.05）。由此表明NO处理可以提高GSH含量，维持较低水平GSSG含量从而提高GSH/GSSG比值，以此达到保护细胞膜，延缓褐变的目的。

2.4 NO熏蒸对果实ASA、DHA含量及其比值的影响

ASA和GSH是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂，保障ASA-GSH循环系统的正常运作，加速H2O2分解，消除H2O2对细胞造成的伤害[28]。如图4a所示，随着贮藏时间的延长，两组枸杞ASA含量总体呈现上升趋势且处理组ASA含量始终高于对照组。除贮藏第6 d外，NO处理组枸杞中ASA含量均显著高于对照组（p＜0.05）。表明外源NO熏蒸可以提高枸杞ASA含量，加快H2O2分解速度，防止过量活性氧自由基对果实产生毒害。这与王静[29]对哈密瓜ASA含量研究结果一致。由此表明，NO处理有助于提高枸杞贮藏期间ASA含量。

APX以ASA为电子供体，可直接清除H2O2，同时ASA被氧化形成DHA，氧化过程中产生的酶可协同作用将DHA再生成ASA[30]，加速H2O2分解。如图4b所示，两组枸杞DHA含量均呈现“升-降-升-降”动态变化，其中处理组浮动程度较大。在整个贮藏过程中，除第18 d外处理组枸杞中DHA含量均显著高于对照组（p＜0.05）。

贮藏0～12 d，处理组ASA/DHA比值先快速下降出现最低值后快速上升。第18 d时处理组枸杞ASA/DHA达到峰值，比对照组高11.77%。由此表明，NO处理提高枸杞贮藏期间ASA含量，保持较高的ASA/DHA（图4c）。

2.5 NO熏蒸对果实POD、CAT和SOD活力的影响

SOD、POD、CAT和APX是清除活性氧自由基重要的酶类[31]，可以协助CAT清除H2O2[30]。由图5a可知，处理组和对照组鲜果中POD活性在贮藏0～6 d快速下降，且贮藏第6 d时，处理组枸杞POD活力显著高于对照组（p＜0.05）；贮藏6～36 d，两组枸杞POD活力整体呈上升趋势，处理组POD活力始终高于对照，在贮藏24～30 d，效果显著（p＜0.05）。由此表明，NO熏蒸提高了冷藏枸杞鲜果POD活力，有助于H2O2的清除。

图5 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果POD（a）、CAT（b）和SOD（c）活力的影响 Fig.5 Effect of NO fumigation on POD (a), CAT (b) and SOD (c) activity of fresh Lycium barbarum fruits during cold storage

CAT是清除活性氧自由基的主要酶类，可以将H2O2分解为H2O，使组织细胞中H2O2始终维持较低水平[32]。由图5b可知，处理组枸杞的CAT活性变化与对照组相似，整个贮藏期间均处于下降趋势，且处理组枸杞一直均保持较高的CAT活力。在贮藏第30 d，CAT活力出现小幅度的上升，但随后继续下降。方差分析结果表明，NO熏蒸可有效抑制枸杞鲜果贮藏期间CAT活力下降，在贮藏前期效果更为显著（p＜0.05）。由此可见，NO处理可抑制CAT活性下降，促进H2O2分解（图2a），防止H2O2积累对细胞产生的破坏[33]，较好维持相对稳定的细胞形态，有效抑制枸杞褐变发生，与外源NO熏蒸芥兰结果类似[34]。

SOD可以催化O2-歧化生成H2O2和O2，为植物细胞清除活性氧自由基[32]。由图5c可以看出，两组枸杞鲜果中SOD活性大致呈现先上升后下降的趋势，但整个贮藏过程中，处理组枸杞SOD活力始终高于对照组，且贮藏中期（12～24 d）效果显著（p＜0.05），表明NO有助于提高SOD活力，从而加快O2-降解（图2b），延缓鲜果贮藏前期褐变进程；结合图1发现贮藏第12 d NO处理组枸杞褐变度比对照组低18.41%，可能是因为NO熏蒸诱导SOD基因表达上升，从而加快清除活性氧自由基的速度[35]，保持了细胞膜结构的完整性，从而降低褐变度。该现象与NO熏蒸猕猴桃的结论相似[36]。由此可见，NO熏蒸可有效维持枸杞贮藏过程中SOD活力，加快活性氧自由基清除速率，保护细胞膜结构，从而延缓果实褐变。

2.6 NO熏蒸对果实APX和GR活力的影响

为尽可能减少甚至消除活性氧自由基的伤害，植物体内存有ASA-GSH循环。APX是一种辅助抗氧化酶[37]，通过氧化ASA来清除植物体内H2O2[38]。APX存在于叶绿体基质中，与CAT协同清除H2O2减轻膜脂过氧化的伤害[39]。由图6a可以看出，对照组与处理组枸杞鲜果在贮藏期间APX活性呈现动态变化。贮藏0～6 d，对照组枸杞中APX高于处理组；但贮藏18～36 d，处理组枸杞APX活力始终高于对照组，与CAT、POD协同作用，加速H2O2分解，在图3a中得到验证。由此说明，NO熏蒸在贮藏中后期（18～36 d）可以有效提高枸杞鲜果贮藏期间APX活性。

GR是GSH和ASA重要的再生酶[38]。由图6b可以看出，贮藏0～6 d，处理组枸杞GR活力低于对照组；贮藏18～36 d，两组枸杞鲜果中GR活力出现不稳定的波动，但NO处理组枸杞GR活力始终高于对照组（p＜0.05），加快贮藏后期GSSG还原进程（图3b），维持充足的GSH含量（图3a）。ASA和GSH是重要的抗氧化物质，其中GSH可通过自身氧化从而还原ASA达到清除H2O2的目的[38-40]。说明18～36 d，GR在催化GSSG还原成GSH方面起到一定作用。本试验研究表明，贮藏后期（24～36 d）处理组枸杞鲜果中GR活力显著高于对照组（p＜0.01）。由此说明，NO熏蒸可以显著提高枸杞鲜果在贮藏后期的GR活力。

图6 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果APX（a）和GR（b）活力的影响 Fig.6 Effect of NO fumigation on APX (a) and GR (b) activity of fresh Lycium barbarum fruits during cold storage

3 结论

在3±0.5 ℃的贮藏条件下，NO熏蒸处理可有效抑制冷藏枸杞鲜果的活性氧代谢和褐变衰老，从而维持果实良好的品质。综上所述，外源NO熏蒸通过提高冷藏枸杞鲜果POD、贮藏0～24 d SOD酶活力以及贮藏12～36 d APX和GR酶活力，抑制CAT酶及贮藏24～36 d SOD酶活力下降，提高ASA和GSH抗氧化物质含量，加快枸杞中活性氧自由基的分解；同时抑制O2-生成速率、H2O2含量的积累和GSSG还原速度，维持自由基代谢平衡，保持细胞完整结构从而减缓枸杞鲜果褐变进程。本研究为外源NO熏蒸在枸杞鲜果保鲜方面的应用提供理论参考。