一测多评法同时测定雷公藤药材及制剂雷公藤多苷片中7个质控成分

姬翔宇，张子雯，陈姿伊，周斌铖，叶春颖，计燕萍*，詹淑玉*

一测多评法同时测定雷公藤药材及制剂雷公藤多苷片中7个质控成分

姬翔宇1, 2，张子雯2，陈姿伊2，周斌铖2，叶春颖2，计燕萍2*，詹淑玉2*

1. 浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 311403 2. 嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001

为提高雷公藤质量控制水平，建立同时测定雷公藤药材及制剂雷公藤多苷片中7个成分的一测多评（quantitative analysis of multi-components with a single-marker，QAMS）方法。采用HPLC法，以雷酚内酯为参照物，计算其它6种成分雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的相对校正因子（f/s），并对f/s进行耐用性考察。搜集不同产地、厂家及不同批号的9批雷公藤药材和10批雷公藤多苷片，分别采用外标法和QAMS法测定7个成分含量，比较两者的差异。各个成分的f/s重复性良好，对19批样品运用QAMS法和外标法得到的各成分含量无显著性差异（相对平均偏差＜3%）；不同厂家、不同批号及不同产地来源的雷公藤多苷片及雷公藤药材中7个成分含量均存在较大差异，说明应提高雷公藤中药的质量控制标准。所建立的QAMS法准确性高，可用于雷公藤药材及其相关制剂的多成分同时定量分析，为雷公藤中药的全面质量控制提供方法参考。

一测多评法；雷公藤；雷公藤多苷片；质量控制；雷酚内酯；雷公藤甲素；雷公藤内酯酮；雷公藤晋碱；雷公藤次碱；雷公藤红素；雷公藤内酯甲；相对校正因子

雷公藤来源于卫矛科雷公藤属植物雷公藤Hook. f.的干燥根，产于浙江、安徽、福建、云南、广西等地，具有清热解毒、消肿止痛、祛风通络、舒筋活血、杀虫止血等功效[1]，主要含有二萜类、三萜类、生物碱和倍半萜类等多种活性成分[2]。雷公藤多苷（polyglycoside）是从雷公藤药材中提取的总苷混合物，为我国首先研究利用的抗炎免疫调节中药提取物，对类风湿性关节炎、糖尿病肾病、紫癜性肾炎、系统性红斑狼疮等难治性或顽固性疾病疗效显著，有“中草药激素”之称[3-7]。雷公藤多苷中的主要成分如雷公藤红素、雷公藤晋碱和雷公藤次碱等既是有效成分也是毒性成分，由其导致的不良反应多发[8-10]，在一定程度上限制了中药雷公藤的临床应用。

目前，市场上雷公藤药材及雷公藤多苷片（polyglycosides Tablets，TWPT）鱼目混杂，不同来源的药材及制剂中主要成分含量往往差异较大，而多数仅以雷公藤甲素或雷公藤红素为单一评价指标[11-14]，质量控制水平不足是雷公藤药材及其制剂产生不良反应的主要原因之一。雷公藤药材及TWPT定性分析研究[15-18]已经广泛开展，而对其多成分的定量研究还很有限，现有方法主要基于HPLC，采用常规的外标法测定了雷公藤药材或TWPT中几种含量较高、且对照品易得的成分[19-20]，还无法全面控制雷公藤药材及其制剂的质量，特别是对于一些对照品难以获取、价格昂贵的成分，对其进行定量分析还存在较多限制。

一测多评（quantitative analysis of multi- components with a single-marker，QAMS）法是近年来在中药研究领域内普遍认可、应用较广泛的中药质量控制模式，它是利用中药各有效成分内在函数关系（相对校对因子，f/s），通过只测定某一典型组分的含量，来实现多指标成分的同步测定[21]。目前，在中药质量控制中QAMS的研究方法体系日益完善，其应用范围不断扩大[22-25]。虽然已有关于雷公藤提取物QAMS法的研究报道[26]，但还存在着测定时间较长、方法普适性不高及分析样本量不足等问题，另外还未见有关雷公藤制剂的QAMS法含量测定。因此，本研究基于优化的HPLC色谱条件，采用QAMS法对不同产地、来源的9批雷公藤药材以及不同厂家、批号的10批TWPT样品中的7个质控成分进行定量分析。以雷酚内酯为参照物，计算雷公藤药材及多苷片中其他6种成分雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的f/s，并对f/s进行耐用性考察，在此基础上对19批样品采用QAMS法进行了多成分含量测定，并与外标法的结果进行比较，证明了QAMS法的可行性。本研究基于QAMS法开展雷公藤药材及制剂TWPT的多指标含量分析，以期为雷公藤药材及制剂的全面质量控制提供技术手段和科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 1200高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；XS105DualRange型十万分之一分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；QE-500型粉碎机，江阴市中恒元机械制造有限公司；HC-1014型高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RE-2000B型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Merck Millipore Milli-Q Reference超纯水系统，美国默克密理博公司。

1.2 试药

对照品雷公藤甲素（批号7675）、雷公藤红素（批号5664）、雷公藤内酯酮（批号4648），质量分数均为98.0%，购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；对照品雷酚内酯（批号C16O8G45829，质量分数99.0%）、雷公藤内酯甲（批号KA0809CB14，质量分数98.0%）购自上海源叶生物科技有限公司；对照品雷公藤次碱（批号DST200819-078，质量分数98.0%）、雷公藤晋碱（批号DST201101-080，质量分数99.0%）购自成都德思特生物技术有限公司。甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司），磷酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），三氯甲烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），水为超纯水。

1.3 药材及制剂

收集不同厂家共10批TWPT及不同产地和来源共9批雷公藤药材进行含量测定，9批药材经嘉兴学院詹淑玉教授鉴定，均为卫矛科雷公藤属植物雷公藤Hook. f.的干燥根。样品信息见表1、2。

表1 TWPT样品信息

Table 1 Sources of TWPT

编号批号生产厂家 S120200502远大医药黄石飞云制药有限公司 S220200402远大医药黄石飞云制药有限公司 S320201101远大医药黄石飞云制药有限公司 S420200903湖南千金协力药业有限公司 S52012112B浙江得恩德制药股份有限公司 S620200902湖南千金协力药业有限公司 S720201101湖南千金协力药业有限公司 S820200503湖南千金协力药业有限公司 S92012115B浙江得恩德制药股份有限公司 S10201003上海复旦复华药业有限公司

表2 雷公藤药材样品信息

Table 2 Sources of T. wilfordii

编号产地来源 Y1浙江浙江中医药中药饮片有限公司 Y2湖北十堰亳州京皖中药饮片厂 Y3云南临沧江苏诚信药业有限公司 Y4浙江农副产品1 Y5安徽亳州市丽春堂药业有限公司 Y6浙江农副产品2 Y7浙江绍兴震元中药饮片有限公司 Y8浙江杭州华东中药饮片有限公司 Y9安徽嘉兴东方国药饮片有限公司

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters SunFire®C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.02%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～10 min，15%～25%乙腈；10～20 min，25%～35%乙腈；20～40 min，35%～40%乙腈；40～60 min，40%～55%乙腈；60～75 min，55%～80%乙腈；75～90 min，80%～88%乙腈；90～100 min，88%～98%乙腈；100～101 min，98%～15%乙腈；101～116 min，15%乙腈；体积流量1.0 mL/min；检测波长：0～65 min，230 nm；65～116 min，210 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。色谱图如图1。

1-雷公藤甲素 2-雷公藤内酯酮 3-雷酚内酯 4-雷公藤晋碱 5-雷公藤次碱 6-雷公藤红素 7-雷公藤内酯甲

2.2 对照品储备液的制备

精密称取雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱、雷公藤红素对照品适量，加甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为2.19、1.49、1.19、4.45、1.87 mg/mL的对照品储备液；精密称取雷公藤次碱、雷公藤内脂甲对照品适量，加氯仿溶解并定容，制成质量浓度分别为6.00、15.20 mg/mL的对照品储备液。储备液于4 ℃冰箱保存备用，保存时间不超过15 d。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 TWPT供试品溶液 精密称取TWPT粉末0.36 g（约含50 mg雷公藤多苷），置50 mL具塞锥形瓶中，加入12 mL甲醇，超声提取30 min，滤过，滤渣用2 mL甲醇洗涤，洗涤液并入滤液后于50 ℃水浴减压旋转蒸发至干，残渣加1 mL氯仿-甲醇（1∶9）混合溶剂超声溶解，所得溶液于10 000 r/min离心（离心半径5.9 cm）5 min，取上清液适量，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得TWPT供试品溶液。

2.3.2 雷公藤药材供试品溶液 取雷公藤药材粉末（过20目筛）约5.00 g，精密称定，置500 mL圆底烧瓶中，加入100 mL氯仿，浸泡过夜后加热回流提取2 h，放冷后滤过，采用15 mL氯仿分次洗涤残渣，洗涤液并入滤液后于50 ℃水浴减压旋转蒸发至干，残渣加2 mL氯仿-甲醇（1∶9）混合溶剂超声溶解，所得溶液于10 000 r/min离心（离心半径5.9 cm）5 min，取上清液适量，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得雷公藤药材供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下各对照品储备液适量混合，加甲醇制成雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲质量浓度分别为172.0、94.5、219.5、5 078.9、537.3、839.8、1 887.3 μg/mL的混合对照品溶液I。精密吸取混合对照品溶液I适量，依次用甲醇稀释2、3、6、15、30、45倍，分别作为混合对照品溶液II、III、IV、V、VI、VII。精密吸取I～VII混合对照品溶液各20 μL，以“2.1”项下色谱条件进样分析，以对照品质量浓度为横坐标（），色谱峰面积为纵坐标（）绘制标准曲线，求算线性回归方程及相关系数（2）分别为雷公藤甲素＝24.689－9.563 5，2＝0.999 6，3.82～172.00 μg/mL；雷公藤内酯酮＝22.729－4.052 4，2＝0.999 6，2.10～94.50 μg/mL；雷酚内酯＝58.866－25.106，2＝0.999 5，4.88～219.50 μg/mL；雷公藤晋碱＝8.125 7＋526.7，2＝0.997 4，112.86～5 078.90 μg/mL；雷公藤次碱＝33.515－37.597，2＝0.999 5，11.94～537.30 μg/mL；雷公藤红素＝40.583－106.55，2＝0.999 6，18.66～839.80 μg/mL；雷公藤内酯甲＝4.5726＋14.157，2＝0.999 7，41.94～1 887.30 μg/mL。结果显示，7种成分在相应的质量浓度范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液II适量，以“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算其RSD值。结果雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲峰面积的RSD分别为3.45%、3.59%、3.68%、3.50%、3.56%、3.75%、3.40%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性试验 分别精密称取TWPT样品（S8）和雷公藤药材样品（Y7）各6份，按“2.3”项下方法分别制备供试品溶液。以“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算7种质控成分平均质量分数及RSD值。结果TWPT样品中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的平均质量分数分别为173.12、106.06、660.82、11 259.99、 1 030.63、884.53、2 591.14 µg/g，RSD分别为1.99%、2.25%、2.82%、2.41%、3.60%、2.53%、2.81%；雷公藤药材样品中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的平均质量分数分别为7.63、1.07、2.19、625.15、4.60、171.67、184.40 µg/g，RSD分别为1.85%、3.02%、3.62%、2.78%、2.56%、3.38%、3.22%，表明该方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 分别精密吸取TWPT（S8）和雷公藤药材（Y7）供试品溶液各适量，于室温下放置0、2、4、8、12、24 h后以“2.1”项下色谱条件进样分析，记录各个测定时间点的峰面积，计算其RSD值。结果TWPT中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲峰面积的RSD分别为2.34%、2.00%、1.09%、1.01%、2.12%、1.89%、1.69%；雷公藤药材中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲峰面积的RSD分别为4.01%、3.06%、1.19%、3.63%、3.20%、3.17%、4.95%，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取0.18 g TWPT样品（S8）6份，精密称定，分别精密加入另行配制的混合对照品溶液1 mL（雷公藤甲素57.32 μg/mL、雷公藤内酯酮31.50 μg/mL、雷酚内酯73.16 μg/mL、雷公藤晋碱3 385.90 μg/mL、雷公藤次碱179.09 μg/mL、雷公藤红素279.92 μg/mL、雷公藤内酯甲629.10 μg/mL），另精密称取2.50 g雷公藤药材样品（Y7）6份，精密称定，分别精密加入另行配制的混合对照品溶液2 mL（雷公藤甲素11.46 μg/mL、雷公藤内酯酮2.10 μg/mL、雷酚内酯4.88 μg/mL、雷公藤晋碱677.20 μg/mL、雷公藤次碱11.94 μg/mL、雷公藤红素279.92 μg/mL、雷公藤内酯甲629.10 μg/mL），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进样分析，测定各成分质量浓度，并计算加样回收率和RSD值。结果TWPT样品中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的平均加样回收率分别为105.2%、103.8%、103.4%、102.1%、108.9%、110.3%、100.6%，RSD值分别为2.29%、2.54%、2.88%、3.26%、2.61%、3.42%、3.23%；雷公藤药材样品中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的平均加样回收率分别为98.6%、87.7%、91.2%、101.1%、99.1%、101.3%、104.4%，RSD值分别为3.13%、2.75%、3.60%、2.23%、2.90%、2.98%、2.17%。

2.5 fk/s测定

精密吸取“2.4.1”项下各混合对照品溶液适量，以“2.1”项下色谱条件进样分析，记录各成分峰面积，以雷酚内酯为参照物，按下列公式分别计算雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的f/s，结果见表3。

f/s＝f/s＝CAs/(sA)

C为待测成分质量浓度，A为待测成分峰面积，s为参照物质量浓度，s为参照物峰面积

2.6 fk/s的耐用性考察

2.6.1 不同仪器和不同色谱柱对f/s的影响 精密吸取混合对照品溶液适量，以“2.1”项下色谱条件进样分析，参照“2.5”项下方法求算各成分f/s，分别考察不同仪器包括Agilent 1260、Agilent 1200、ThermoFisher UltiMate 3000高效液相色谱仪及不同色谱柱包括Agilent Zorbax Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters SunFire® C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）对f/s的影响，结果如表4所示，各成分f/s的RSD值均小于3%，表明更换仪器或色谱柱对各成分的f/s无显著影响，适用性良好。

表3 雷酚内酯对各成分的fk/s

Table 3 fk/s of triptophenolide to various constituents

混合对照品溶液fk/s 雷公藤甲素雷公藤内酯酮雷公藤晋碱雷公藤次碱雷公藤红素雷公藤内酯甲 I1.635 02.385 73.877 71.229 31.236 64.745 5 II1.591 92.363 83.865 41.277 81.245 94.664 2 III1.619 12.430 53.831 81.188 01.288 84.710 1 IV1.610 12.416 13.737 31.198 11.281 94.486 0 V1.661 02.313 73.697 21.183 11.343 84.425 0 VI1.655 02.421 43.625 21.176 71.281 64.634 5 VII1.705 42.396 13.783 81.219 11.304 34.461 0 平均值1.639 72.389 63.774 11.210 31.283 34.589 5 RSD/%2.311.702.472.922.792.82

2.6.2 不同体积流量对f/s的影响 精密吸取混合对照品溶液适量，以“2.1”项下色谱条件进样分析，参照“2.5”项下方法求算各成分f/s，考察3个体积流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）对f/s的影响，结果如表5所示，各成分f/s的RSD均小于3%，表明不同体积流量对各成分f/s无显著影响。

2.6.3 不同柱温对f/s的影响 精密吸取混合对照品溶液适量，以“2.1”项下色谱条件进样分析，参照“2.5”项下方法求算各成分f/s，考察3个柱温（25、30、35 ℃）对f/s的影响，结果如表6所示，各成分的RSD均小于3%，表明不同柱温对各成分f/s无显著影响。

2.7 待测成分色谱峰定位

精密吸取混合对照品溶液适量，以“2.1”项下色谱条件进样分析，分别计算雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲对参照物雷酚内酯的相对保留时间（R），对各成分进行色谱峰定位。结果如表7所示，各成分R的RSD均小于5%，表明可利用R对各成分进行定位。

2.8 QAMS法与外标法测定结果比较

对表1、2来自不同厂家、批号和不同产地和来源的TWPT和雷公藤药材，分别以“2.3.1”和“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进样测定，分别采用标准曲线外标法和QAMS法计算含量。结果如表8所示，2种方法测定的各成分含量无明显差异，相对平均偏差（RAD，RAD＝平均偏差/平均值，其中平均偏差即2组测量值与其平均值的差值取绝对值后求和，再除以2）均小于3.0%。

表4 不同仪器、不同色谱柱对fk/s的影响

Table 4 Effects of different instruments and chromatographic columns on fk/s

仪器色谱柱fk/s 雷公藤甲素雷公藤内酯酮雷公藤晋碱雷公藤次碱雷公藤红素雷公藤内酯甲 Agilent 1200Waters C181.619 72.399 73.909 21.278 41.239 94.692 8 Agilent C181.586 62.365 93.867 41.273 51.222 54.653 3 Welch C181.623 52.403 23.936 11.280 31.249 24.767 5 Kromasil C181.611 12.383 73.911 81.273 01.225 94.702 5 Agilent 1260Waters C181.591 72.350 33.830 81.282 41.220 14.441 5 Agilent C181.563 72.329 23.794 81.285 31.222 14.428 5 Welch C181.602 12.366 13.854 71.287 51.215 74.475 8 Kromasil C181.585 72.342 73.829 11.285 31.216 34.422 1 UltiMate 3000Waters C181.602 62.345 93.872 21.301 11.212 54.700 0 Agilent C181.564 92.315 63.810 21.289 81.205 14.603 9 Welch C181.641 82.357 33.873 81.292 01.216 84.654 8 Kromasil C181.584 52.346 73.864 61.298 41.226 94.626 0 平均值 1.598 22.358 93.862 91.285 61.222 74.597 4 RSD/% 1.461.131.100.690.982.67

表5 不同体积流量对fk/s的影响

Table 5 Effects of different volume flow rates on fk/s

体积流量/(mL∙min−1)fk/s 雷公藤甲素雷公藤内酯酮雷公藤晋碱雷公藤次碱雷公藤红素雷公藤内酯甲 0.81.603 12.383 83.905 61.278 01.249 04.696 3 1.01.586 62.365 93.867 41.273 51.222 54.653 3 1.21.573 82.351 93.843 21.275 31.228 54.665 5 平均值1.587 92.367 23.872 11.275 61.233 34.671 7 RSD/%0.930.680.810.181.130.48

表6 不同柱温对fk/s的影响

Table 6 Effects of different column temperatures on fk/s

柱温/℃fk/s 雷公藤甲素雷公藤内酯酮雷公藤晋碱雷公藤次碱雷公藤红素雷公藤内酯甲 251.585 12.361 63.872 71.276 61.239 04.666 6 301.586 62.365 93.867 41.273 51.222 54.876 3 351.579 92.350 43.862 41.276 81.232 24.662 1 平均值1.583 92.359 33.867 51.275 61.231 24.735 0 RSD/%0.220.340.130.150.672.58

3 讨论

3.1 供试品溶液制备

为筛选最优的TWPT及雷公藤药材供试品溶液制备方法，本研究分别对样品预处理、提取溶剂和提取方法等进行了考察。

表7 不同仪器、不同色谱柱对tR的影响

Table 7 Effects of different instruments and chromatographic columns on tR values

仪器色谱柱tR 雷公藤甲素雷公藤内酯酮雷公藤晋碱雷公藤次碱雷公藤红素雷公藤内酯甲 Agilent 1200Waters C180.409 00.707 81.060 71.108 81.433 61.512 7 Agilent C180.382 40.653 51.050 21.122 61.511 51.597 0 Welch C180.412 20.707 81.063 51.107 31.444 31.522 4 Kromasil C180.405 00.697 91.063 21.110 01.457 11.537 7 Agilent 1260Waters C180.407 00.705 31.061 51.109 31.432 41.511 2 Agilent C180.380 80.650 01.050 81.124 21.513 31.598 7 Welch C180.412 10.707 91.062 91.107 01.441 01.517 7 Kromasil C180.404 90.696 21.061 61.109 71.452 41.531 4 UltiMate 3000Waters C180.403 70.706 31.054 91.106 01.416 71.493 7 Agilent C180.378 30.650 51.048 01.122 11.497 61.581 8 Welch C180.408 90.709 21.058 91.104 61.427 61.503 6 Kromasil C180.402 40.698 51.057 81.106 81.437 91.516 3 平均值 0.400 60.690 91.057 81.111 51.455 41.535 4 RSD/% 3.123.510.520.642.292.38

表8 各成分测定结果

Table 8 Results of content determination of various constituents

样品雷酚内酯/(μg∙g−1)雷公藤甲素/(μg∙g−1)雷公藤内酯酮/(μg∙g−1)雷公藤晋碱/(μg∙g−1) 外标法外标法QAMSRAD/%外标法QAMSRAD/%外标法QAMSRAD/% S1252.9317.2516.901.016.155.931.853 833.143 793.380.52 S2288.2412.1211.622.1015.2515.200.163 460.313 424.870.51 S3253.9231.1331.160.0529.4930.111.054 119.284 073.920.55 S4402.99164.66164.130.1664.8364.510.248 523.748 344.831.06 S537.4687.2388.190.5416.3916.370.051 658.611 664.160.17 S6463.97234.59234.500.0288.0189.130.639 112.148 913.911.10 S7365.37199.91199.910.00104.49106.070.7512 729.4112 444.381.13 S8636.44170.44169.630.24100.40101.560.5811 121.3710 843.301.27 S929.36326.13331.260.78210.53220.162.241 427.351 444.390.59 S1033.19145.87145.880.0036.3836.580.273 418.253 375.490.63 Y112.702.412.311.9824.3424.871.07132.04130.280.67 Y25.451.911.841.895.235.280.50137.19137.550.13 Y36.671.721.642.508.258.320.45123.76123.460.12 Y42.621.581.551.041.361.370.65124.23128.531.70 Y52.361.941.940.051.281.310.8687.8691.562.06 Y610.242.182.092.1213.9113.591.15119.10117.880.52 Y72.257.988.151.041.111.130.70648.50667.151.42 Y85.392.522.461.0611.4711.660.82177.38177.800.12 Y97.142.422.341.5211.6511.760.48173.93173.160.22

续表8

对于TWPT，采用简单的超声提取方法[27]对比了不同提取溶剂甲醇、乙醇、氯仿及醋酸乙酯对提取效果的影响，结果发现用甲醇超声提取30 min，各待测成分溶出度较高，且各成分色谱峰之间分离度和峰形良好，故选择甲醇超声提取作为TWPT供试品溶液制备方法。

对于雷公藤药材，分别对比了样品是否浸泡预处理、不同提取溶剂（甲醇、乙醇及氯仿）、不同提取方法（超声提取和加热回流提取）以及提取物是否经固相萃取等对制备效果的影响，结果发现将药材浸泡过夜、氯仿为提取溶剂、加热回流提取2h可以使各成分获得较优的提取效率，同时各成分色谱峰之间分离度和峰形均较好；而采用固相萃取处理与未采用相比，各成分分离度和色谱峰峰形未有明显改善，且固相萃取后目标成分有一定量的损失，故对药材提取物不采用固相萃取处理。

3.2 色谱条件的优化

雷公藤药材及TWPT成分复杂，多数成分含量较低，为了使多成分达到较好的分离效果，对流动相的组成和比例进行了考察，首先比较了水相分别添加甲酸、醋酸、磷酸和磷酸-三乙胺对梯度洗脱分离效果的影响，结果显示水相中加入少量磷酸可显著改善各成分色谱峰峰形。进一步考察了不同体积分数（0.02%、0.05%、0.10%）磷酸水对色谱行为的影响，结果显示水相中添加0.02%磷酸时，各成分色谱峰的分离度和峰形最优，故以0.02%磷酸水溶液-乙腈作为流动相。

雷公藤各成分具有不同的最大紫外吸收波长，为了使各成分获得较高的检测灵敏度，需要采用不同波长分段检测。参照文献报道[1,3,28-29]对7个成分分别在210、218、230、267、425 nm波长下的响应进行了考察，筛选最优检测波长。综合考虑各成分的含量、紫外响应值、出峰时间及检测波长的简单性，最后选择雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱和雷公藤次碱的检测波长为230 nm，检测时间段为0～65 min；雷公藤红素和雷公藤内酯甲的检测波长为210 nm，检测时间段为65～116 min。

3.3 指标成分和参照物的选择

雷公藤中主要含有二萜类、三萜类和生物碱等生物活性成分，这些成分共同构成雷公藤的物质基础[2]。为有助于雷公藤药材及其制剂的全面质量控制，我们分别选择了活性明确、含量较高的各类代表性成分作为QAMS法含量测定的指标成分，主要包括二萜类成分雷公藤甲素、雷公藤内酯酮和雷酚内酯，三萜类成分雷公藤红素和雷公藤内酯甲以及生物碱类成分雷公藤晋碱和雷公藤次碱。从各成分含量测定结果和各成分色谱分离情况看，雷酚内酯含量适中，与其它成分分开明显，在谱图中较易识别，其保留时间约为56 min，处于色谱图的中位，利于其它成分色谱峰的相对保留时间计算和色谱峰的识别，且雷酚内酯性质稳定、价廉易得，因此，本研究选择雷酚内酯作为QAMS法含量测定的参照物。

3.4 含量测定结果及QAMS法的准确性

本研究搜集了10批不同厂家和批号的TWPT制剂以及9批不同来源或产地的雷公藤药材进行了7个指标性成分的含量测定，结果显示，10批制剂中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的质量分数分别为11.62～331.26、5.93～220.16、29.36～636.44、1 427.35～12 729.41、35.68～978.06、74.41～2 052.93、1 753.99～2 994.06 μg/g；9批药材中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的质量分数分别为1.55～8.15、1.11～24.87、2.25～12.70、87.86～667.15、3.19～9.69、11.53～179.07、33.11～199.84 μg/g。不同厂家、不同批号及不同产地来源的TWPT及雷公藤药材中7种成分含量均存在较大差异，这种差异可能与药材来源和质量、生产过程和工艺控制水平等诸多因素有关，因此，还应提高雷公藤中药的质量控制标准。

本研究建立QAMS法用于同时测定雷公藤药材及制剂中7种成分含量，以雷酚内酯为参照物，对其它6种成分的f/s进行了包括仪器、色谱柱、柱温、体积流量以及色谱峰定位的耐用性考察，说明QAMS法具有良好的重现性。对19批样品分别采用外标法和QAMS法求算7种成分含量，结果表明2种方法测定的含量无显著性差异，证明了QAMS法的准确性。

本研究所建立方法可用于雷公藤及其相关制剂的多成分定量分析，为雷公藤中药的全面质量控制提供新的方法参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 王亚丹, 汪祺, 张建宝, 等. 雷公藤制剂的化学成分及质量研究现状 [J]. 中国中药杂志, 2019, 44(16): 3368-3373.

[2] 肖治均, 刘传鑫, 杨欣欣, 等. 雷公藤研究进展及其质量标志物的预测分析 [J]. 中草药, 2019, 50(19): 4752-4768.

[3] 何昱, 石森林, 张茹萍, 等. 雷公藤多苷主要有效成分的含量研究 [J]. 药物分析杂志, 2013, 33(2): 197-200.

[4] 刘冰, 袁红亮, 汪洪波, 等. 雷公藤多苷片联合依那西普治疗类风湿性关节炎的疗效及其对血清14-3-3η蛋白、抗环瓜氨酸肽抗体水平的影响[J]. 药物评价研究, 2021, 44(3): 561-565.

[5] 白雪, 付瑞嘉, 乐世俊, 等. 雷公藤治疗类风湿性关节炎研究进展 [J]. 中草药, 2020, 51(1): 265-275.

[6] 汪靓雯, 邹新蓉, 王长江, 等. 雷公藤多苷治疗过敏性紫癜性肾炎随机对照试验的系统评价 [J]. 中国中药杂志, 2018, 43(13): 2806-2816.

[7] 秦万章. 雷公藤治疗系统性红斑狼疮研究现状的展望 [J]. 中国中西医结合杂志, 2000, 20(12): 884-885.

[8] Li Y H, Zhu W, He H L,. Efficacy and safety ofHook. F for connective tissue disease-associated interstitial lung disease: A systematic review and meta-analysis [J]., 2021, 12: 691031.

[9] 李志霞, 马冬梅, 杨兴华, 等. 雷公藤用药者血液系统不良事件发生率的Meta分析 [J]. 中国中药杂志, 2015, 40(2): 339-345.

[10] 李唯, 陈阿虹, 阙慧卿, 等. 雷公藤内酯醇结构修饰和构效关系研究进展[J]. 药物评价研究, 2019, 42(8): 1651-1662.

[11] 吴霞, 黄文华, 郭宝林, 等. 雷公藤制剂中雷公藤红素的含量研究 [J]. 中国中药杂志, 2009, 34(7): 836-838.

[12] 夏焱, 王文燕, 张彦文, 等. HPLC法测定雷公藤及其片剂中雷公藤红素 [J]. 中草药, 2005, 36(8): 1154-1156.

[13] 濮存海, 何明芳, 张晓骞, 等. HPLC测定雷公藤总萜片中雷公藤内酯醇的含量 [J]. 中国中药杂志, 2005, 30(4): 266-267.

[14] 鲍立曾, 刘法千, 熊仕强. HPLC法测定雷公藤多苷中雷公藤内酯醇的含量 [J]. 药物分析杂志, 2007, 27(6): 896-898.

[15] Li K, Wang S D. Fingerprint chromatogram analysis of extracts from the leaves ofHook. F. by high performance liquid chromatography [J]., 2005, 28(7): 653-657.

[16] 高旋, 宋敏, 庄莹, 等. 雷公藤药材及制剂的HPLC特征图谱研究 [J]. 药物分析杂志, 2009, 29(5): 702-709.

[17] Su P, Cheng Q Q, Wang X J,. Characterization of eight terpenoids from tissue cultures of the Chinese herbal plant,, by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry [J]., 2014, 28(9): 1183-1192.

[18] Duan Y P, Luo J Y, Liu C M,. Rapid identification of triptolide inproducts by gold immunochromatographic assay [J]., 2019, 168: 102-112.

[19] 张聪聪, 黄建明, 俞媚华, 等. HPLC法测定雷公藤提取物中雷公藤甲素及两种生物碱的含量 [J]. 复旦学报: 医学版, 2009, 36(3): 333-336.

[20] 庄莹, 宋敏, 杭太俊, 等. 雷公藤多苷片中雷公藤总内酯及雷公藤内酯醇的测定 [J]. 药物分析杂志, 2008, 28(1): 36-40.

[21] 王智民, 钱忠直, 张启伟, 等. 一测多评法建立的技术指南 [J]. 中国中药杂志, 2011, 36(6): 657-658.

[22] 李佳寅, 张小平, 方梦婷, 等. 一测多评法同时测定生脉注射液中12个成分[J]. 中草药, 2021, 52(24): 7484-7492.

[23] 许啸, 张淹, 刘晓云, 等. 复方阿胶浆质量标准提升研究[J]. 中草药, 2021, 52(20): 6226-6233.

[24] Su C N, Li C H, Sun K,. Quantitative analysis of bioactive components in walnut leaves by UHPLC-Q- Orbitrap HRMS combined with QAMS [J]., 2020, 331: 127180.

[25] Stavrianidi A, Stekolshchikova E, Porotova A,. Combination of HPLC-MS and QAMS as a new analytical approach for determination of saponins in ginseng containing products [J]., 2017, 132: 87-92.

[26] 吴珏, 刘志宏, 林兵, 等. 一测多评法同时测定雷公藤提取物中6种成分含量 [J]. 福建中医药, 2019, 50(1): 32-35.

[27] 梁健, 沈熊, 朱孝国, 等. 雷公藤多苷片的HPLC指纹图谱 [J]. 中国临床药学杂志, 2013, 22(1): 9-13.

[28] 张玉蕊, 吴明侠, 杨晶凡. 雷公藤饮片标准汤剂的研究 [J]. 时珍国医国药, 2020, 31(1): 87-89.

[29] 刘为萍, 刘素香, 唐慧珠, 等. 雷公藤研究新进展 [J]. 中草药, 2010, 41(7): 1215-1218.

Simultaneous quantitative determination of seven components inherbs and preparations ofpolyglycosides Tablets by QAMS method

JI Xiang-yu1, 2, ZHANG Zi-wen2, CHEN Zi-yi2, ZHOU Bin-cheng2, YE Chun-ying2, JI Yan-ping2, ZHAN Shu-yu2

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311403, China 2. Medical College of Jiaxing University, Jiaxing 314001, China

To improve quality control level of Leigongteng (), a traditional Chinese medicine, the method of quantitative analysis of multi-components with a single-marker (QAMS) was established to simultaneously determine seven components inherbs (TWH) and preparations ofpolyglycosides Tablets (TWPT).Using triptophenolide as the reference, the relative correction factors (f/s) of other components of triptolide, triptonide, wilforgine, wilforine, tripterine and wilforlide were calculated by HPLC, and then the durability off/swas investigated. Nine samples of TWH and 10 samples of TWPT from different origins, manufacturers and batch numbers were collected and their components were determined using the external standard method (ESM) and QAMS method, respectively. The determination results of sevem components in 19 samples using ESM and QAMS method were compared.The repeatability off/sfor each component was good. There was no significant difference (RAD < 3%) between the measured values of QAMS method and ESM. The components contents in TWH from different origins and TWPT from different manufacturers and batch numbers were both greatly different. The results demonstrated quality control standard ofshould be improved.The established QAMS method has high accuracy and it can be used for the simultaneous quantitative determination of multiple components in TWH and preparations of.. This method will provide a method reference for the comprehensive quality control of..

QAMS;Hook. f.;polyglycosides Tablets; quality control; triptophenolide; triptonide; triptonide; wilforgine; wilforine; tripterine; wilforlide; relative correction factors

R286.02

A

0253 - 2670(2022)17 - 5338 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.010

2022-02-17

国家自然科学基金资助项目（81503338）；浙江省基础公益研究计划项目（LGF22H280004）；嘉兴市科技计划项目（2020AY10022）；嘉兴学院重点SRT资助项目

姬翔宇，硕士研究生，研究方向中药质量控制。E-mail: jxy912912@163.com

詹淑玉，博士，教授，研究方向为中药药理学与中药药动学。E-mail: zhansy2000@163.com

计燕萍，硕士，实验师，研究方向为中药药剂学和中药药理学。E-mail: 623220865@qq.com

[责任编辑 郑礼胜]