新疆某肉牛屠宰场空肠弯曲菌同源性分析及生物膜形成能力测定

彭 斌，朱亚磊，刘英玉，王金泉

(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)是弯曲菌中最易引起人和动物各类细菌性肠道的病原菌之一[1]。人食入受污染的畜产品可引起腹泻或食物中毒，甚至继发格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)[2]，家畜感染可引起肝炎和流产等[3]，近年来，欧洲、澳洲和北美地区弯曲菌病的发病率很高[4]。空肠弯曲菌感染人和动物已成为疾病防控部门重点关注的内容[5]。新疆是我国主要的畜牧业基地之一，随着畜牧业的不断发展，屠宰场加工环节细菌污染情况更为严峻，空肠弯曲菌的污染情况也随之加重[6]，感染空肠弯曲菌导致人畜疾病数量日益增多。国内外对牛源空肠弯曲菌的同源性分析及生物膜成膜能力的研究相对较少。本文为研究肉牛屠宰环节空肠弯曲菌的污染及其生物膜的形成提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 空肠弯曲菌标准菌株ATCC33291，由新疆农业大学动物医学学院畜产品质量与安全实验室保存。

1.1.2 试剂 空肠弯曲菌选择性培养基改良CCDA琼脂基础、哥伦比亚血平板、布氏肉汤和MH肉汤培养基，青岛日水生物技术有限公司产品；10 g/L结晶紫、PCR相关试剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；引物为16S rDNA，上游引物序列：AATCACTGGGCGTAAAGG，下游引物序列：CGGTATTGCGTCTCATTGTAT，生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 主要仪器 恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；C-32型厌氧罐、微需氧产气袋，日本三菱MGC公司产品；STAT-FAX2100酶标仪，美国Awareness Technology公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 2020年10至12月在新疆乌鲁木齐市某牛屠宰场采集拭子样品264份。用无菌生理盐水浸润的无菌棉签在牛胴体表面刮取，将拭子插入含有5 mL甘油肉汤的离心管中并标记，置于泡沫盒中低温保存，当天运回实验室进行处理。

1.2.2 细菌分离培养 将牛胴体拭子样品的布氏肉汤增菌液，直接放置于加入微需氧产气袋后的厌氧罐里，密封后42℃恒温培养36 h～48 h，涂布棒将100 μL菌液均匀涂布于改良CCDA平板，42℃微需氧培养48 h；改良CCDA平板上灰色、透明、水珠状疑似菌落用无菌接种环划线于CCDA平板上纯化培养48 h，上述步骤重复2次～3次，典型菌落接种于哥伦比亚血平板继续微需氧培养48 h，纯培养菌落待用。

1.2.3 16S rDNA鉴定及同源性分析 模板制备：血平板上纯培养单菌落用水煮法提取模板，即DNA模板[7]，置-20℃保存备用。PCR反应体系25 μL：Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 11 μL。反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，共32个循环；72℃ 10 min。PCR产物经电泳凝胶成像系统观察拍照后，特异性扩增片段由上海生工测序，阳性菌株使用DNA Star中的Megalign进行同源性分析。

1.2.4 空肠弯曲菌生物膜鉴定 将冻存于-20℃冰箱中的空肠弯曲菌菌株接种于配置好的布氏肉汤中，42℃下培养48 h进行活化，经2次活化后的菌液培养于中性条件的MH肉汤溶液内，37℃恒温培养随时间的推移对空肠弯曲菌生物膜的形成能力进行测定。

生物膜的制备：利用96孔板结晶紫染色法，在孔中加入制备好的MH肉汤180 μL和20 μL菌液，以200 μL MH肉汤(pH7)培养液作为阴性对照。37℃下培养72 h，小心弃去96孔板内所有培养液，放入60℃烘箱处理15 min，加入950 mL/L甲醇进行固定15 min。再使用无菌的PBS清洗96孔板，重复2～3次，继续烘干。每孔加入200 μL 1%结晶紫染液，避光染色30 min，打开实验室水龙头缓慢清洗染色的96孔板，直到流水为无色，继续烘干96孔板。每个孔加入200 μL 950 mL/L乙醇，洗脱约5 min，用酶标仪测定590 nm下OD值并取平均值，无菌的培养基所在的孔作为阴性对照，进行背景矫正，得到空肠弯曲菌生物膜的相对定量。菌株的生物膜形成能力：弱生物膜形成能力OD5902OD590-blank[8]。

2 结果

2.1 分离纯化结果

42℃微需氧48 h培养后，在CCDA平板上的菌落形态为扁平湿润、有黏性，沿接种线向外扩散(图1)，哥伦比亚血琼脂平板上的特征菌落为半透明、白色(图2)，可判定为空肠弯曲菌疑似菌株。

2.2 16S rDNA鉴定结果

对疑似空肠弯曲菌分离株进行16S rDNA基因PCR鉴定，结果显示20株扩增得到约711 bp的片段，与预期大小一致(图3)。10株疑似空肠弯曲菌分离株的PCR产物扩增片段测序经Blast比对，结果表明分离株与NCBI上已发布的空肠弯曲菌的序列同源性为99%以上。

图1空肠弯曲菌在CCDA培养基上菌落形态

图2空肠弯曲菌在哥伦比亚血琼脂平板上菌落形态

M.DNA标准DL 2 000 ；1.标准阳性菌株；2.阴性对照；3～12.样品

2.3 空肠弯曲菌分离鉴定结果及同源性分析

264份胴体拭子样品分离10株空肠弯曲菌，分离率为3.79 %,将10株空肠弯曲菌编号，分别为CJ1-CJ10进行同源性分析(图4)。用分析软件DNAstar对10株空肠弯曲菌的16S rDNA基因的核苷酸构建遗传进化树(图5)，CJ3和CJ9、CJ6和CJ8、CJ5和CJ10分别处于同一小分支，与CJ1、CJ4和CJ7处于同一大分支；CJ2菌株与其他所有菌株之间亲缘关系距离较远但属于同一大分支。

2.4 空肠弯曲菌生物膜形成能力测定结果

2.4.1 牛源空肠弯曲菌在37℃ OD值测定结果 牛源空肠弯曲菌37℃培养24、48、72 h后，用酶标仪测出样品OD值，并通过GraphPad Prism 8.0.1进行单因素方差分析。结果培养后72 h，样品OD值最高，培养72 h比培养48 h测定的OD值高，培养24 h后OD值最小(图6、图7)。

图4分离株序列分析

图5空肠弯曲菌16S rDNA基因核苷酸的进化树分析

2.4.2 牛源空肠弯曲成膜能力测定结果 空肠弯曲菌在相同培养条件下，37℃时随着培养时间的增加其成膜能力也逐渐增强。培养72 h，10株空肠弯曲菌中强成膜株占90%(9/10)、中等成膜株占10%(1/10)；在48 h和24 h的培养条件下，强成膜株分别为60%(6/10)、50%(5/10)，中等成膜株分别为30%(3/10)、20%(2/10)，弱成膜株则全部为20%(2/10)(表1)。

Blank为阴性对照;CJ1-CJ10为样品1～10Blank.Negative control；CJ1-CJ10.Samples1-10

图7 37℃培养不同时间生物膜形成能力结果

表1 37℃下不同时间空肠弯曲菌成膜能力

3 讨论

近年来空肠弯曲菌引起腹泻比例越来越高[9]。空肠弯曲菌在新疆库尔勒地区牛源检出率为4.83%[10]。本文对新疆乌鲁木齐牛源空肠弯曲菌污染情况进行调查，在肉牛屠宰场共采集264份胴体拭子，分离鉴定得到10株空肠弯曲菌，检出率为3.79%(10/264)，用DNAStar中的Megalign对这10株空肠弯曲菌进行16S rDNA基因序列同源性分析及遗传进化树分析，同源性为94.0%～99.6%，CJ3和CJ9、CJ6和CJ8、CJ5和CJ10分别处于同一小分支，与CJ1、CJ4和CJ7处于同一大分支；CJ2菌株与上述其他菌株的亲缘关系稍远但属于同一大分支，分离株亲缘性较近。该牛屠宰场空肠弯曲菌分离株亲缘性较近，屠宰场受到空肠弯曲菌不同程度的污染，该菌还存在水平传播现状。

空肠弯曲菌传播过程可形成生物膜，在37℃恒温条件下，用MH肉汤培养空肠弯曲菌，随着培养时间的延长生物膜形成能力越强，生物膜很难从黏附表面上祛除，并且生物膜一旦形成就对消毒剂抵抗并会在食品的加工中引起二次污染[11]，空肠弯曲菌能够在肉品或操作环节上形成生物膜，为空肠弯曲菌传播提供有利条件[12]。本研究对肉牛屠宰场采集到的264份样品分离得到10株空肠弯曲菌，通过结晶紫染色法鉴定其生物膜。结果表明，在不同培养时间下空肠弯曲菌生物膜形成能力存在极显著差异(P<0.001)，在24、48、72 h随着时间的延长空肠弯曲菌生物膜的形成能力也逐渐增强。空肠弯曲菌作为一种食源性人兽共患病原菌，其致病机理尚不明确，而空肠弯曲菌生物膜的形成可能是导致该细菌存在致病性的诱因[13]。因此，未来科研工作者对空肠弯曲菌生物膜致病机制领域的研究越发重要，对今后空肠弯曲菌的传播、感染以及治疗控制有着重大的意义，为人们的食品安全保障提供参考依据。