小米多糖的提取及抑菌作用研究

2022-09-08 03:51赵建英张森虎李艳松
中国饲料 2022年17期
关键词:供试多糖小米

赵建英,张森虎,李艳松,李 详,白 建

(吕梁学院生命科学系,山西吕梁 033001)

小米有很高的营养价值,常被用来制作各种养生粥,还可以用来发酵酿酒,因此对小米多糖的工艺提取可以开发出新的营养丰富且健康的食品(Yang等,2021)。 高晶晶等(2020)研究表明,小米多糖具有一定的抗氧化性,其质量浓度与抗氧化性成正比。王玺等(2016)研究表明,多糖提取率与液固比成正相关,增大液固比,多糖能够有效的融到溶液中,提高多糖提取率。刘丹丹等(2019)研究表明,多糖可以抑制细菌的生长,对革兰氏染色为紫色的抑菌效果最好。宋乐园(2020)通过对红小米多糖提取研究后,得出了红小米多糖的最佳提取条件。路志芳等(2017)研究表明,植物多糖可以广泛应用于医疗行业和食品保健领域等,目前已经利用植物多糖研发出一些医疗药品,治疗病毒感染和肿瘤,改善人体的免疫功能,预防心血管疾病等,比如香菇多糖的应用。Wang等(2019)研究表明,原位葡聚糖生产改变了小米的营养价值,导致游离酚类含量和抗氧化活性增加。已有的研究发现HSP-3可作为功能性食品中的活性成分(Huo等,2020;Sharma等,2019)。

本研究以沁州小米为主要原料,按单因素试验,选出提取时间、提取温度、料液比三个因素进行响应面试验(高涛等,2020),确定小米多糖最佳提取条件。对提取出的小米多糖采用滤纸片法(Xu等,2020;Li等,2019)进行抑菌研究,测定其对供试菌的抑菌效果,确定最低抑菌浓度。并研究不同温度和pH对小米多糖抑菌能力的影响,为小米多糖的开发利用提供理论依据和实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 沁州小米采购于吕梁星玛客超市,酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、苯酚、牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、琼脂等均是分析纯,供试菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)由吕梁学院微生物实验室提供。

1.2 主要仪器HH系列数显恒温水浴锅:上海禾汽玻璃仪器有限公司;SC-04低速离心机:张家港市腾鹰机械制造有限公司;FA114A电子秤:广东豪晟科学仪器有限公司;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅:河南省泰斯特仪器有限公司;UV-1601紫外分光光度计:青岛聚创华业分析仪器有限公司;101-00AB恒温鼓风干燥箱:邢台钜都科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小米预处理 将沁州小米置于60℃恒温干燥箱中,干燥40 min。

1.3.2 小米多糖提取 取5 g小米放入烧杯中,加入100 mL蒸馏水,将烧杯放入恒温水浴锅中,在80℃下浸提2 h,取出提取液用滤纸进行过滤,然后将滤液用低速离心机3900 r/min离心25 min,然后取上清液,加入60 mL 95%乙醇,再3900 r/min离心20 min,然后过滤,得到小米粗多糖(诸爱士等,2019),溶解沉淀并定容,取15 mL溶液与烧杯中,然后加盐酸溶液2 mL,置于60℃水浴锅中加热20 min,静置冷却,然后滴一滴酚酞试剂,用2 mL 2 mol/mL的氢氧化钠溶液滴定至淡红色,将溶液倒入50 mL容量瓶中,摇匀得到小米多糖溶液,用3,5二硝基-水杨酸法(王明瑞等,2020)检测多糖的含量,以此计算小米多糖提取率。

1.3.3 DNS试剂配制 称取3,5-二硝基水杨酸3.15 g,酒石酸钾钠91.0 g,苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g,采用詹梦涛等(2020)的方法配制DNS试剂。配制完成后,放置在棕色瓶中避光储存,室温下存放一周后使用。

1.3.4 葡萄糖标准曲线的绘制 根据罗春萍等(2021)的方法配制葡萄糖标准溶液。分别取葡萄糖 标 准 液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL和1.60mL于5mL比色管中,用蒸馏水补至2.50mL,滴加DNS试剂2 mL,100℃加热10 min,然后静置冷却,在波长为540 nm处进行检测,读出吸光度值。绘制葡萄糖溶液的标准曲线。

1.3.5 小米多糖含量的测定 取2 mL小米多糖溶液于25 mL具塞试管中,加入2 mL DNS试剂,加热一段时间,然后静置冷却,加入10 mL蒸馏水,对照组用蒸馏水,然后在540 nm波长处进行检测,读出吸光度值,计算出小米多糖的提取率(张小贝等,2017)。小米多糖提取率的计算公式:φ=((ρ-V)×0.9)/m×100。

1.4 单因素试验 由预试验得到提取时间为2 h,提取温度为80℃,液料比为20:1,多糖提取率最高达3.27%。分别改变提取时间(1、1.5、2、2.5、3 h),提取温度(70、75、80、85、90℃),料液比(10:1、15:1、20:1、25:1、30:1),以此进行小米多糖的提取。

1.5 响应面优化试验 利用单因素试验得出的数据,进行BBD响应面法试验(张环宇等,2020),以提取时间(A)、提取温度(B)、料液比(C)作为三个影响因素,以小米多糖提取率为考察指标。响应面分析因素与水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平

1.6 小米多糖抑菌试验

1.6.1 牛肉膏蛋白胨培养基的制作 采用汤强等(2018)的方法配制牛肉膏蛋白胨培养基,在无菌环境下操作。

1.6.2 菌悬液的制备 取10 mL的蒸馏水于试管中,用酒精灯加热,在酒精灯旁冷却后倒入接种管中,塞上棉塞,摇晃7~9次,然后倒入试管中,备用。

1.6.3 抑菌圈的测定 把滤纸用打孔器做成直径为6 mm大小的形状,在培养皿中加入5 mL过滤后的小米多糖提取液,充分浸泡1 h后,用酒精灯灼烧镊子,待冷却后用镊子将滤纸贴在培养基上,然后放在37℃培养箱中培养1 d。用无菌水为对照组,测量抑菌圈的直径大小,试验进行3次,取中间值(李世杰等,2018)。配制10 mg/mL的青霉素钠溶液为阳性对照(许海燕等,2020)。

1.6.4 小米多糖最低抑菌浓度的测定 用二倍肉汤稀释法(毛畅思等,2021)测定小米多糖提取液的最低抑菌浓度(MIC),小米多糖提取液用无菌水连续稀释最终质量浓度为0、0.1427、0.2854、0.5708、1.1416、2.2832、4.5664、9.1328 mg/mL, 在37℃恒温培养箱培育24~36 h后,当试管中没有菌落生长时,以测定最小抑菌浓度。

1.6.5 不同温度对小米多糖抑菌能力的影响 将提取出的小米多糖均分为5份,放入烧杯中,在恒温条件下将小米多糖提取液的温度调为20、50、80、100、130℃,并恒温加热30 min,以无菌水为对照组,然后用滤纸片法对3种供试菌的抑菌效果进行测定,平行3次试验(唐志凌等,2021;高晶晶等,2020)。

1.6.6 不同pH对小米多糖抑菌能力的影响 将提取出的小米多糖均分为5份,利用1 mol/L的盐酸和1 mol/L的氢氧化钠溶液将小米多糖提取液的pH调为1、4、7、10、13, 以无菌水为对照组,然后用滤纸片法对3种供试菌的抑菌效果进行测定,平行3次试验 (吴孔阳等,2021;刘永永等,2021;吴孔阳等,2020)。

1.7 数据处理 所有的基础数据都在Microsoft Excel 2010中归纳整理,单因素试验作图利用Graphpad Prism8.0,利用Design-ExPert 11软件对Box-Behnken(BBD)响应面试验进行分析,最后使用Adobe Photoshop CC 2021对所得的所有图片进行修饰。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线 由图1可知,标准曲线的线性回归方程为:Y=0.6157X-0.0712,R2=0.984。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 提取时间对小米多糖提取率的影响 图2表明,在提取1~2 h时,小米提取率从1.26%增长到2.86%,提取时间增加后,提取率又开始降低。这是因为用热水浸提时,小米在一段时间后才能破坏细胞壁,而多糖要溶解在溶液中也需要一定的时间,一定时间浸提后,更多的多糖溶解到溶液中,而提取时间太长,会使的多糖在高温下发生糖酵解,稳定性降低,所以小米多糖最佳提取时间为2 h。

图2 提取时间对多糖提取率的影响

2.2.2 提取温度对小米多糖提取率的影响 由图3可以看出,在温度为70~80℃时,随着温度的升高,多糖提取率升高,在80℃后,多糖提取率下降,这是因为热处理可以破坏小米细胞,使多糖溶解在水中,温度升高会提高物质的扩散系数,加快溶解。在一定的时间内使多糖提取率增加,但过高的温度会使多糖变性,而使多糖提取率减少。因此,小米多糖的最佳提取温度为80℃。

图3 提取温度对多糖提取率的影响

2.2.3 料液比对小米多糖提取率的影响 从图4可以看出,料液比可改变溶液的浓度以及溶液黏度等,当料液比的比例变大时,溶液中多糖的浓度降低,多糖提取率增大。但当料液比的比例太大时,溶解速度过快,多糖提取变得困难,增加了损耗,导致多糖损失。由图4可以看出,当料液比增大时,多糖提取率快速增加,而料液比再变大后,多糖提取率反而降低。因此,当料液比为20:1时,小米多糖提取量最多。

图4 料液比对多糖提取率的影响

2.3 响应面优化结果

2.3.1 响应面试验结果分析 运用Design-Expert 11软件对表1和表2中的数据进行多元回归拟合,并进行模型优化,得到回归方程:Y=3.04+0.1963A+0.0510B—0.0890C—0.0438AB+0.0413AC+0.0317BC-0.4989A2-0.2054B2-0.2919C2。

表2 试验设计和结果

对模型的显著性进行检验,由表3可知,响应面模型P<0.0001,表明拟合检验极显著,失拟检验P=0.9814>0.05,表明失拟项不显著,这说明方程模拟比较好,可以用该模型进行预测。

由表3可以看出,相关系数R2=0.9957,表明模型显著。校正系数R2Adj=0.9901,说明该模型只有0.99%无法解释。两个差值小于0.2,说明具有一致性,模型与实际情况拟合很好。变异系数CV=1.42%,模型可靠,可以较好地反映真实试验值,所选用的二次多项模型有效。

对模型的各系数显著性检验分析可知 (表3),因素A、B、C表现为极显著;交互项AB表现为显著,AC、BC表现为不显著, 二次线A2、B2、C2表现为极显著。该模型中的F值可以看出三个因素对多糖提取率都有非常显著的影响,其中A、B、C的值分别为230.03、15.53、47.31,所以可以得出A、B、C对多糖提取率的影响力由大到小为:提取时间>料液比>提取温度。

表3 回归模型方差分析

2.3.2 交互作用分析 由图5可知,因素A与因素B相互作用3D曲面弯折程度大,坡度较峭,且等高线为椭圆形,说明因素A与因素B之间的交互作用对小米多糖的提取率影响显著。从3D图可以看出,当因素A为2 h,因素B为80℃时小米多糖提取率最高,为3.051%。从等高线可以看出,因素B对小米多糖提取率的影响小于因素A,说明在因素A与因素B中,小米多糖提取率主要受因素A的影响。

图5 提取时间和提取温度对多糖提取率影响的响应面图和等高线图

由图6可知,因素A与因素C相互作用3D曲面弯折程度小,坡度较缓,且等高线近似为圆形,说明因素A与因素C之间的交互作用对小米多糖的提取率影响不显著。从3D图可以看出,当因素A为2 h,因素C为20:1时小米多糖提取率最高,为3.042%。从等高线可以看出,因素C对小米多糖提取率的影响小于因素A,说明在因素A与因素C中,小米多糖提取率主要受因素A的影响。

图6 提取时间和料液比对多糖提取率影响的响应面图和等高线图

由图7可知,因素B与因素C相互作用3D曲面弯折程度小,坡度较缓,且等高线近似为圆形,说明因素B与因素C之间的交互作用对小米多糖的提取率影响不显著。从3D图可以看出,当因素B为80℃,因素C为20:1时小米多糖提取率最高,达2.969%。从等高线可以看出,因素B对小米多糖提取率的影响小于因素C,说明在因素B与因素C中,小米多糖提取率主要受因素C的影响。

图7 提取温度和料液比对多糖提取率影响的响应面图和等高线图

2.4 验证试验 运用响应面设计软件对回归方程进行计算,将提取时间、提取温度、料液比的取值分别设定为1.5~2.5 h,75~85℃,15:1~25:1,并将目标值设定为最大值。获得的最佳提取条件为:提取时间2.11 h,提取温度80.6℃,料液比19.2:1。按此提取条件提取的小米多糖提取率为3.067%,根据实际操作情况将最优组合修改为提取时间2.1 h,温度80℃,料液比19:1,在此条件下平行3次试验。提取的小米多糖提取率为3.066%,与预测值接近,这说明回归模拟准确可用,利用响应面结合主成分分析法优化小米多糖的提取的方法准确可行。

2.5 小米多糖的抑菌能力

2.5.1 小米多糖对供试细菌的抑菌测定 由表4可知,小米多糖对供试菌都具有抑制作用。且相对于阳性对照组,小米多糖的抑菌效果更强,其中小米多糖对革兰氏阳性菌的抑菌效果最好,其抑菌直径可达(12.75±1.76)mm。小米多糖对革兰氏阴性菌的抑菌效果较弱,其抑菌圈直径为 (10.03±1.53)mm,小米多糖对枯草芽孢杆菌的抑制效果最弱,其抑菌圈直径为(8.77±0.79)mm。

表4 小米多糖对供试菌的抑菌效果 mm

2.5.2 小米多糖对供试菌的最低抑菌浓度 由表5可知,小米多糖提取液对三个供试菌的最小抑制浓度分别为1.1416、2.2832、4.5664 mg/mL, 小米多糖提取液对细菌的抑制作用随浓度的增大而增强。

表5 小米多糖对供试菌的最低抑菌浓度

2.5.3 不同温度下小米多糖对供试菌抑菌的测定从图8可以看出,温度的变化不会明显影响小米多糖的抑菌效果,即使120℃下处理小米多糖后,其仍然具有抑菌能力。但随着温度的升高,小米多糖的抑菌效果会稍微降低,这是由于高温破坏了小米多糖的结构。

图8 不同温度对供试菌抑菌的影响

2.5.4 不同pH下小米多糖对供试菌的测定 从图9可以看出,不同酸碱度条件下的小米多糖的抑制作用有所不同,pH越趋于中性,小米多糖的抑菌效果越佳,在pH为7时,小米多糖对大肠杆菌的抑制效果最佳。而在酸性或碱性条件下,小米多糖的抑制能力都会受到影响,pH越低或越高,小米多糖的抑制能力越弱,这是由于强酸或强碱会破坏小米多糖的结构,活性降低,从而影响小米多糖的抑菌效果。

图9 不同pH对供试菌的影响

3 结论

用热水提法对沁州小米进行多糖提取,采用单因素试验和响应面优化试验相结合的方法,对小米多糖的提取条件进行优化得出:在提取时间2.1 h、提取温度80℃、料液比19:1条件下,沁州小米多糖的平均提取率为3.066%。通过响应面模型分析可以得出,三个因素对小米多糖提取率的影响顺序为:提取时间>料液比>提取温度。对提取出的小米多糖进行抑菌作用研究表明,小米多糖对三种供试细菌都有一定的抑制作用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为1.1416、2.2832、4.5664 mg/mL。 对在不同温度和pH条件下小米多糖对供试菌的抑菌研究得出,温度的升高并不会明显影响小米多糖的抑菌效果,强酸和强碱会降低小米多糖的抑菌效果,在中性条件下,小米多糖的抑制效果最佳。

猜你喜欢
供试多糖小米
4 种牧草种子在不同逆境下的萌发特性
黄芪多糖对肝癌Hep G2.215细胞的抑制作用及其机制研究
传递
小麦全程绿色防控用药试验分析
小麦全程绿色防控用药试验分析
发酵虫草多糖提取工艺优化及其体外抗氧化、免疫活性研究
小麦全程防控应用拜耳公司农药产品试验
ALA-PDT联合卡介菌多糖核酸肌注治疗尖锐湿疣的效果观察
杜小米的夏天
浒苔多糖的提取工艺研究