CRISPR/Cas9系统在猪中的应用研究进展

许 栋 ，许园芳 ，谢拥军 ，马海明 ，彭济红

（1.岳阳职业技术学院生物环境工程学院，湖南 岳阳 414000；2.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128；3.临湘市柳厂梅花鹿养殖专业合作社，湖南 岳阳 414316）

现代畜牧业中，养猪的最终目标之一是提高瘦肉率、降低脂肪含量、提高猪肉品质和口感。猪肉作为大多数中国人餐桌上必不可少的蛋白质来源，对日常生活有着巨大的影响，因此，积极开展猪的遗传育种改良具有重要意义。我国本地猪种的遗传资源具有抗病性强、适应性强、性成熟早、遗传性能稳定等优良特性。随着时间的推移，研究人员通过将我国本地猪种与国外猪品种杂交等传统遗传改良方法，在改善本地猪种产仔数、胴体瘦肉率、生长速度和抗病性等方面取得了显著成果，但这些研究进展都比较缓慢，往往需要几十年才能取得有效突破。传统的基因改良速度慢、成本高、效率低，而新兴的基因编辑技术在猪的遗传改良中具有广阔的应用前景。自CRISPR/Cas9开始在猪群成功应用以来，在改善猪生长性状方面取得了多项突破。随着对动物肌肉生长相关基因如肌生成抑制素（Myostatin，MSTN）的深入研究，解耦联蛋白1（Uncoupling protein 1，UCP1）和胰岛素样生长因子2基因（Insulin-like growth factor 2 gene，IGF-2）功能的发现，运用基因组编辑技术提供了在短时间内改良本地猪种的研究思路，具有巨大的发展潜力和应用前景。文章简要描述了CRISPR/Cas9系统的发展过程、在猪生产应用中的研究进展，以及通过CRISPR/Cas9系统对猪基因组引入适当的修饰，并对猪器官被人体利用的可能性进行了概述，同时对CRISPR/Cas9应用前景进行了展望。

1 CRISPR/Cas9系统技术概述

CRISPR/Cas9系统可以在基因组的特定位点引入DNA双链断裂，通过非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重组（Homologous recombination，HR）实现DNA修复。在NHEJ过程中，DNA双链断裂（DNA double-strand break，DSBs）外可能会出现小片段的插入或缺失，导致移码突变或过早产生终止密码子敲除基因。CRISPR/Cas9系统特异性高、操作简单，被广泛应用于很多大型动物的基因组编辑中，如猪、牛、绵羊和猴。在CRISPR/Cas9系统被使用以前，克隆绵羊多利的出生使得体细胞核移植（the somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术成了那个时代的热点，被从事相关领域的专家们选择用于家畜动物的研究，SCNT技术是基于培养的家畜原代细胞上的研究方法，在体外研究过程中，利用HR技术对供体基因组中的目标基因进行敲除，将目标基因进行重新整合，但通过HR技术正确整合一个目标DNA序列非常不容易，通常只有百万分之一的细胞会携带正确的整合序列，还会导致功能性的基因被意外敲除，这些克隆后的阳性细胞经过长时间的选择和增殖后，最终会以衰亡的状态结束。具有正确整合序列的细胞可应用于去核卵母细胞的重建，由此产生的转基因后代是克隆出来的，所有的遗传物质与亲代细胞完全相同。自20世纪90年代末以来，SCNT技术使家畜的转基因研究迅速发展，可即便该技术被改良进步了，在实施上仍存在诸多困难，世界上仅有几个重点实验室真正掌握了该项技术。使用成年动物的供体细胞克隆出第一个哺乳动物距离现在已经20多年了，但SCNT技术的效率依然非常低，目前只有不到10%的整合细胞成功转移到受体，并产生了可存活的后代，在对猪的研究中，仅有3%～5%的移植胚胎产生了可存活的后代。因此，尽管SCNT技术能够产生经基因敲除处理的动物，但这个技术效率仍然不高，价格相对昂贵，且需要大量的专业知识，全球范围内掌握该技术的实验室也很少。基于此背景，CRISPR/Cas9系统的出现给基因研究领域的专家们带来了新的研究思路和方向。

2 CRISPR/Cas9系统技术在猪中的研究应用

2.1 CRISPR/Cas9系统技术以猪为模型的病理研究

将CRISPR/Cas9系统作为基因组编辑工具，大大提高了基础生物学中科学模型的研究效率，猪作为生物医学模型治疗人类的疾病已经有了多年的研究历史，该模型在大小和生理上都与人类非常相似。在猪这种缺乏真实胚胎干细胞系的物种中，这项技术彻底改变了创建DNA编辑和转基因动物的能力。通过向合子里直接注射CRISPR/Cas9修饰后的RNA或通过具有CRISPR/Cas9修饰的体细胞核来生产修饰猪胚胎，如，将人白蛋白cDNA通过CRISPR/Cas9系统技术导入到猪体细胞核内，从而使猪产生了人血清白蛋白，可用于治疗人血液相关的一些疾病。CRISPR/Cas9系统技术还用于靶向猪受精卵中的血管性血友病因子基因（von Willebrand factor，vWF）来模拟人类血管性血友病。也有一些研究表明，经基因编辑后的猪作为人类疾病的模型用来研究动脉硬化、糖尿病和肥胖症、苯丙酮尿症以及癌症的治疗方法是可行的。杜氏肌营养不良症（Duchenne muscle dystrophy，DMD）和贝克肌营养不良（Becker Muscle Dystrophy，BMD）都属于肌肉萎缩症，是人类遗传性肌肉营养不良症，是一种不治之症，由编码营养不良素中的DMD基因突变引起，通过使用CRISPR/Cas9系统注射猪受精卵成功靶向了DMD基因，导致了DMD特异性表型，说明DMD修饰的小型猪是一种可靠且有用的动物疾病模型，可以概括人类的DMD/BMD形态表型。

黑皮质素受体3（Melanocortin 3 Receptors，MC3R）属于黑皮质素受体家族（melanocortin receptor family）成员，是神经性黑皮质素受体，MC3R主要在下丘脑中表达，也可以在胎盘、肠、心脏、肾脏和腹膜巨噬细胞中发现，在许多生理过程中起着至关重要的作用，包括脂肪代谢、能量稳态和免疫反应等。目前，在人类基因组中已经发现了41个以上的位点与肥胖症有关，这其中就包括了MC3R基因，为了进一步研究MC3R的生理功能，使用CRISPR/Cas9系统和SCNT技术生产出了MC3R基因敲除（MC3Rknock out，MC3R-KO）猪，经分析其生长性能数据发现MC3R-KO猪的体重和脂肪率均显著高于对照组，同时还发现MC3R-KO猪出现了肥胖表型，这一结论使得猪成为了研究人类肥胖症的潜在模型，对未来的研究具有非常重要的价值。

2.2 CRISPR/Cas9系统技术对猪器官的异种移植研究

人类预期寿命的延长，导致了慢性疾病和器官衰竭患者数量的增加，器官移植是治疗终末期器官衰竭的有效途径，但人体器官的供需不平衡是现代器官移植学中的一个矛盾问题，异种移植是减少或消除这一矛盾最有效的方法之一。异种移植指不同物种共患细胞、组织或器官移植、植入或输注给受体（一般指人体）的任何程序。家猪被认为是最适合供给人体器官的物种，猪器官与人类器官的生理高度相似性使得将猪作为健康供体移植到人类患者体内成为可能，在某种情况下是不可替代的一类工具。第一批基因敲除猪是为异种移植应用而设计的，基因组编辑系统的使用允许对多个等位基因和基因进行编辑，称为多路复用，这允许快速生成携带多种基因修饰的转基因猪，以改进异种移植猪模型。选择猪作为供体动物有以下几点原因：1）产仔数较大，生长周期短；2）器官大小和生理上与人非常相近；3）人畜共患病传播的风险较低。然而，人体的免疫屏障对植入的异种器官引发的排斥反应，阻碍了猪器官的直接异种移植。有研究表明，采用CRISPR/Cas9系统技术，引入适当的修饰手段到猪基因组，可以有效减少异种移植的排斥反应，可能使猪的异种移植更接近于临床应用。哥伦比亚大学转化免疫学中心的研究学者，利用猪器官做异种移植的实验以狒狒为研究对象，通过α-1，3-半乳糖转移酶基因（α-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）敲除的供体和带血管化胸腺组织的共移植，实现了维持狒狒猪肾异种移植的存活时间达83 d，后采用改良的免疫抑制方法，给受体移植了CRISPR/Cas9系统修饰后的猪肾脏，随着器官的生长，出现了血清肌酐升高，但没有组织学或免疫学上的排斥反应证据，并将狒狒的平均生存期增加至125 d。

2.3 CRISPR/Cas9系统技术治疗猪疾病的研究

CRISPR/Cas9系统技术是新开发的基于可编程核酸内切酶的基因工程工具，相较以前的技术手段更高效、更便宜、更简单，渐渐垄断了基因编辑领域。使用CRISPR/Cas9系统已经产生了许多转基因动物，如zebrafish，Drosophila，mouse和monkeys等。对猪CD163基因进行DNA编辑后，培养出的个体对猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）具有一定的抗性，这一研究结果在猪生产上有很大的应用前景。在猪Rosa26位点通过CRISPR/Cas9系统技术敲入抗病毒小发夹RNA（Small hairpin RNA，shRNA），然后采用SCNT技术制备了抗猪瘟病毒转基因（anti classical swine fever virus transgenic，TG）猪，这些TG猪可以有效限制猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）的复制，降低猪瘟相关的临床症状和死亡率，且抗病能力可以稳定地遗传给F1代，利用TG猪可以减少CSFV给养猪业带来的经济损失，这一抗病毒方法为国内其他物种的抗病毒研究提供了参考依据。塞内加谷病毒（Seneca valley virus，SVV）是一种新兴的RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属，感染后会导致猪出现水疱病，其临床症状与口蹄疫相似，给养猪业会造成重大的经济损失。维甲酸诱导基因I（Retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）是先天免疫系统中的关键细胞溶胶受体，在不同的病毒感染过程中扮演不同的角色。在猪的转基因研究中，使用CRISPR/Cas9系统生成了具有先天免疫系统的RIG-I KO猪细胞系，经对照实验发现，RIG-I的表达在RIG-IKO细胞中被完全破坏，大大增加了SVV的传播；且RIG-I负责感知SVV和激活SVV感染细胞中的I型干扰素途径，RIG-I的过表达显著抑制了SVV的传播，从而降低了SVV病毒的感染率。以上研究结论给了科学家一些新的研究思路，RIG-I作为一个潜在的靶点，在正在开发的一种可用作预防SVV传播的潜在疫苗的过程中，利用CRISPR/Cas9系统来修饰细胞系，可以提高疫苗中的病毒产量，有效疫苗的研发成功将大大降低SVV病毒给养猪业带来的经济损失。近几年，非洲猪瘟的传播导致国内养殖企业受到了严重的经济损失，依据CRISPR/Cas9系统的研究理论，生产出预防非洲猪瘟传播的疫苗指日可待。

2.4 CRISPR/Cas9系统技术对猪遗传育种的应用研究

猪的基因组编辑在猪生产中有着重大的潜在应用价值，基于CRISPR/Cas9系统技术的基因组工程将加速畜禽的繁殖和性状改良。将外源基因整合到不同基因组中通常会导致表达不稳定、基因沉默和不可预测的基因表达模式，且在某些情况下，这个过程是会被诱变的，因此生产带有特定基因组位点整合的外源基因动物更有效。我国本地猪种如宁乡猪、东北民猪均属于脂肪型品种，能生产出倍受人民大众欢迎的猪肉，但这些猪品种的脂肪含量过高、瘦肉率低，改善这些品种的脂肪性状是提高猪肉生产的必要步骤。小鼠体内UCP1基因负责褐色脂肪组织的介导生热作用，在抵御寒冷和调节能量稳态中起着关键作用，并且能够减少脂肪存储。有学者依据这一研究结论，结合SCNT技术，通过CRISPR/Cas9技术介导，将小鼠脂联素-UCP1高效插入猪内源性UCP1基因座，由此产生的UCP1-KI猪相比未经处理的猪，脂肪率和背膘厚显著降低，但日常能量需求、饲料转化率及体力水平均没有降低，UCP1-KI猪能较好地维持体温，可以降低猪脂肪沉积和提高瘦肉率，这种转基因猪模型的发展，不仅对猪的性状改良有重要意义，还可以提高猪的经济价值。肌生成抑制素（Myostatin，MSTN）作为转化生长因子-β超家族的一员，是肌肉生长的负调控因子，在改善家畜生长性能方面具有重要的前景。有研究表明MSTN敲除（knock-out）小鼠的肌肉质量比野生型的小鼠大得多，MSTN自然突变的牛品种表现出更大的肌肉量,而猪MSTN基因在进化过程中经历的选择过程与牛羊的MSTN基因有些不同，可能是因为MSTN基因在猪身上表现出不同的表达模式，起不同的作用。猪是世界上最重要的畜禽之一，而中国的猪肉消费量尤其巨大，因此，构建MSTN基因敲除猪对研究肌肉发育和肉用性能的影响具有重要意义。通过高效的CRISPR/Cas9技术系统和SCNT，生产出的MSTN-KO仔猪与同窝仔猪相比，出生体重增加了15%，CRISPR/Cas9诱导的突变可破坏MSTN的功能，MSTN-KO猪模型有望在将来产生更大的肌肉量，提升养殖效益。由于天生缺乏完善的免疫系统，新生仔猪很容易感染致病因子导致死亡，全球每年因此造成经济损失高达数十亿美元。母猪初乳中所特有的乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种具有免疫活性的乳蛋白，仔猪吃过初乳后可获得被动免疫，LF有助于在肠黏膜上方形成保护层，并利于仔猪发育的抗菌和抗病毒活性，因此仔猪遭受肠炎或腹泻的概率较小，但是随着泌乳期的增加，母猪乳汁中的LF分泌量会减少，生产上常用LF人工补充仔猪日粮来促进仔猪的生长。通过CRISPR/Cas9系统介导的同源重组，在猪酪蛋白ɑ-s1（Casein alpha-s1，CSN1S1）基因的3’端具有无标记的LF基因位点特异性敲入，乳铁蛋白可以在酪蛋白ɑ-s1启动子的控制下在乳腺中过表达，且在分泌的初乳和常乳中均持续高表达，与对照组相比，转基因猪的乳汁具有抑菌作用，这一研究成果为猪的育种工作提供了新的研究思路。

随着对基因组的深入研究，功能性LncRNA的鉴定成了当前研究中的一个热点，尤其已发现数万个与肌肉发育相关的LncRNA，通过高通量测序技术可进一步探索其功能。近年来，通过CRISPR/Cas9系统之类的基因编辑技术可以在体内和体外鉴定功能性LncRNA，针对LncRNA的sgRNA文库的构建和肌肉细胞的有效筛选系统的建立，将有利于骨骼肌中关键功能性LncRNA的筛选，这些发现将为猪肉品质改良的机理研究提供参考依据。

3 展望

CRISPR/Cas9基因编辑技术效率高、操作方便，该技术在猪身上的广泛应用，为猪经济性状的快速改善带来了机遇，具有非常重要的应用价值。基于CRISPR/Cas9的基因编辑工具的出现，为研究人员提供了以更精确和有效的方式，来提高改良猪品种的能力。然而，大多数针对猪品种改良的基因编辑工作，仍处于阐明基因组功能和调控机制阶段，并没有满足猪基因组编辑的所有要求。如CRISPR/Cas9系统可以有效地在同一胚胎内同时靶向两个基因，唯一的额外步骤是需引入一个带有crRNA的CRISPR，这说明与其他大范围核酸酶相比，破坏多重基因更容易，这说明该技术可用于靶向可能具有补偿作用的基因簇或基因家族，因此除非所有基因都被破坏，否则很难确定单个基因的作用。基于这个理论，CRISPR/Cas9技术可以通过提高体细胞中基因靶向的效率和直接通过受精卵注射来产生转基因猪。随着生物技术的不断改进，其在保护不同品种的猪、提高饲料效率和猪肉产量以及未来开发抗生素替代品方面具有广阔的前景。