狼毒大戟的化学成分及细胞毒活性研究

葛继芸，周艳卿，邱彦，王建，周瑾，李盛建，赵亮，曹青青*（.上海东方肝胆外科医院药材科，上海 0048；.上海市宝山区罗店医院药剂科，上海 0908；.上海市浦东新区人民医院药剂科，上海 000）

狼毒大戟又名猫眼睛，为大戟科大戟属植物狼毒大戟（

Euphorbia fischeriana

Steud.）的干燥块根，为多年生草本植物，主要生长于丘陵坡地以及林缘地带。在我国主要分布于内蒙古、东北及河北等地区，药源充足，资源丰富。《神农本草经》中记载狼毒有泄水逐饮，破积杀虫的功效，主治水肿腹胀，痰食虫积，心腹疼痛，结核，疥癣等，但其味苦、辛，性平，有大毒，现代药理学研究表明狼毒大戟具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗结核、免疫调节等作用，但由于大毒制约了其临床应用和新药开发。

近年来，国内外诸多学者对狼毒大戟做了大量研究，狼毒大戟的临床应用也逐渐被人们重视。狼毒大戟主要以根入药，故诸多研究主要基于狼毒大戟总提取物或提取部位探索活性，对于具体活性成分尚不明确。狼毒大戟的化学成分主要有二萜类、倍半萜类、苯乙酮类及黄酮类等，而对于单体化合物的活性成分研究报道不够深入。为了扩大与利用狼毒大戟的临床应用与新药开发，其单体化合物的研究显得尤为重要。因此，本文采用色谱分离制备技术，对狼毒大戟的化学成分进行提取、分离、鉴别，同时采用MTT 法研究其单体化合物对肝癌细胞与乳腺癌细胞的毒性作用，旨在进一步探索狼毒大戟单体化合物的药理作用，为临床安全有效的应用和药材的进一步开发提供实验数据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1260 高效液相色谱仪、Agilent 6220飞行时间质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Bruker AVANCE Ⅲ 600 高分辨核磁共振波谱仪（德国布鲁克科技有限公司）；SMART-N 超纯水机（香港力康生物医疗科技控股有限公司）；RE-52 型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；CO培养箱（美国Thermo）；TS-100 摇床（海门其林贝尔）；Multiskan MK3 酶标仪（美国Thermo）；XDS-200倒置显微镜（上海蔡康光学）；全自动手持式细胞计数器Scepter 2.0（美国Millipore）；18 XW-80A型旋涡混合器（海门其林贝尔）；SB3200-T 超声发生器（上海科导，50 kHz，120 W）；AE240 型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒）。

1.2 试药

所用试剂均为分析纯（江苏强盛功能化学股份有限公司），水为自制超纯水。玻璃色谱柱（江苏南通三晶玻璃仪器有限公司）；反相C硅胶（日本大曹株式会社）；柱色谱用硅胶、硅胶GF254 薄层板（山东烟台江友化工有限公司）。

乳腺癌细胞株MDA-MB-231、Sum149、MCF-7、ZR-75-1、SKBr3、BT474、肝癌细胞株HepG2（南京科佰生物科技有限公司）；紫杉醇（北京谱析，纯度：98%）；澳洲胎牛血清、DMEM 培养基、PBS 溶液、0.5%胰蛋白酶（美国Gibco 公司）。

中药狼毒大戟饮片购自安徽（产地西藏）；经海军军医大学药学院生药教研室的韩婷副教授鉴定为大戟科大戟属植物狼毒大戟

Euphorbia fischeriana

Steud.的干燥根。标本存放于上海诗丹德生物技术公司留样库。

2 方法与结果

2.1 提取和分离

取狼毒大戟药材30 kg 粉碎后，用80%的乙醇于65℃下回流提取两次，合并两次提取液减压回收至无乙醇残留，得粗提液16 L。取粗提液2 L，加水使其混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，每次加入萃取溶剂2 L。合并各萃取层溶液，减压回收溶剂，得石油醚浸膏80 g，乙酸乙酯浸膏90 g，正丁醇浸膏300 g。

取乙酸乙酯浸膏采用正相硅胶柱色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯系统从50∶1 逐渐过渡到1∶1 梯度洗脱，收集其中薄层点相似的流分，得到流分Fr1 ～Fr6；从Fr2 通过反相C硅胶柱（丙酮∶乙酸乙酯∶甲醇梯度洗脱）分离得到化合物3（20 mg），7（33 mg），8（78 mg）；采用反相C硅胶柱从Fr3（氯仿-甲醇梯度洗脱）分离得到化合物1（21 mg），2（30 mg），4（38 mg）；从Fr4应用反相C硅胶柱（氯仿-甲醇梯度洗脱）分离得到化合物6（34 mg）；从Fr5 应用反相C硅胶柱（氯仿-甲醇梯度洗脱）分离得到化合物5（28 mg）；从Fr6 也通过反相C硅胶柱（氯仿-甲醇梯度洗脱）分离得到化合物9（26 mg）。

2.2 结构鉴定

对狼毒大戟中分离得到的9 个化合物进行MS、H-NMR 谱与C-NMR 谱的波谱数据采集，解析波谱数据并与参考文献对比，推测化合物的结构，结构见图1。

图1 9 个单体化合物的结构式Fig 1 Structures of 9 compounds

化合物1：白色针晶，CHO，ESI-MS 的质核比（

m/z

）为331.19 [M ＋H]。H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：4.03（1H，s，11-H），3.67（1H，s，14-H），2.28（1H，s，9-H），2.08（3H，s，17-CH），0.93（3H，s，20-CH），0.85（3H，s，19-CH），0.82（3H，s，18-CH）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：169.6（C-16），148.6（C-13），130.3（C-15），85.2（C-12），66.1（C-8），60.9（C-11），55.4（C-14），53.5（C-5），48.0（C-9），41.3（C-1），39.2（C-10），39.2（C-3），35.6（C-7），33.5（C-4），33.5（C-18），21.9（C-19），20.8（C-6），18.4（C-2），15.4（C-20），8.7（C-17）。以上数据与文献报道基本一致，推测化合物为岩大戟内酯B。化合物2：黄色针晶，CHO，ESI-MS 的质核比（

m/z

）为391.10 [M ＋H]。H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：13.19（1H，s，4-OH），9.15（1H，s，6-OH），8.82（1H，s，6'-OH），6.02（1H，s，5-H），3.95（3H，s，2-OCH），3.84（3H，s，4'-OCH），3.74（2H，s，CH），2.66（3H，s，3'-COCH），2.63（3H，s，3-COCH），2.06（3H，s，5'-CH3）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：203.8，32.5（3-COCH），202.3，30.5（3'-COCH），163.0（C-6），162.7（C-4'），162.6（C-4），162.5（C-2'），160.6（C-6'），155.8（C-2），110.8（C-1'），110.7（C-5'），107.6（C-3'），105.2（C-1），105.2（C-3），92.4（C-5），64.7（4'-OCH），55.7（2-OCH），16.2（CH），8.7（5-CH）。以上数据与文献报道基本一致，推测化合物为ebracteolatain A。化合物3：浅黄色针晶，CHO，ESI-MS的质核比（

m/z

）为377.08 [M ＋H]。H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：12.81（1H，s，4-OH），9.11（1H，s，6-OH），8.67（1H，s，6'-OH），6.32（1H，s，5'-OH），6.02（1H，s，5-OH），3.97（3H，s，2-OCH），3.84（3H，s，4'-OCH），3.71（2H，s，CH），2.61（3H，s，3-OCH），2.67（3H，s，3'-OCH）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：205.3，33.9（3-COCH），203.5，31.8（3'-COCH），166.1（C-2'），164.6（C-6），164.3（C-4），164.1（C-6'），163.9（C-4'），159.7（C-2），109.8（C-1'），106.6（C-3），104.0（C-1），104.0（C-3'），93.8（C-5'），93.8（C-5），66.1（2-COCH），57.1（4'-COCH），17.4（CH），该化合物5 号位上无甲基取代，其他位置的化学位移与ebracteolatain A 基本一致。HMBC 谱图显示，H-2 OCH（

δ

3.91）与C-2（

δ

159.7）相关，H-4'（

δ

3.84）与C-4（

δ

163.9）相关，H-5（

δ

6.02）与C-6（

δ

164.6）相关，H-5'（

δ

6.32）与C-6'（

δ

164.1）相关，H-6' OH（

δ

8.67）与C-5'（

δ

95.8）相关，进一步确认该化合物与ebracteolatain A 结构相似。推测该化合物为3，3'-二乙酰基-2，4'-二甲氧基-2'，4，6，6'-四羟基-二苯基甲烷。通过SciFinder 检索未发现与该化合物结构一致的文献报道，故确认该化合物为新发现的化合物，且在狼毒大戟中首次报道。化合物4：无色细针晶，CHO，ESIMS 的质核比（

m/z

）为409.38 [M-COOCH]。H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：5.18（1H，t，

J

＝3.6 Hz，H-12），4.45（1H，dd，

J

＝7.8 Hz，H-3），2.03（3H，s，CHCO），1.13（3H，s，CH-27），0.97（6H，s，CH-25，26），0.96（6H，s，CH-29，30），0.87（6H，s，CH-23，24），0.81（3H，s，CH-28）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：171.2（C-32），145.5（C-13），121.9（C-12），81.2（C-3），55.5（C-5），47.8（C-9），47.5（C-18），47.0（C-19），41.9（C-14），40.1（C-8），38.5（C-21），37.9（C-1），37.4（C-4），37.1（C-22），34.9（C-10），33.6（C-21），32.8（C-7），32.7（C-17），31.3（C-20），28.6（C-23），28.3（C-15），27.2（C-28），26.4（C-16），26.2（C-27），23.9（C-30），23.8（C-2），23.8（C-11），21.5（C-31），18.5（C-6），17.0（C-26），16.9（C-24），15.8（C-25）。以上数据与文献报道基本一致，推测化合物为

β

-香树酯醇乙酸酯。化合物5：无色针晶，CHO，ESI-MS 的质核比（

m/z

）为197.07 [M ＋H]。H-NMR（600 MHz，DMSO）

δ

：14.22（1H，s，2-OH），10.53（1H，s，4-OH），6.07（1H，s，H-5），3.78（3H，s，6-OCH），2.53（3H，s，1-COCH），1.88（3H，s，3-CH）；C-NMR（150 MHz，DMSO）

δ

：204.1，34.6（1-COCH），165.9（C-4），164.6（C-6），162.7（C-2），106.1（C-3），104.5（C-1），92.3（C-5），57.4（6-OCH），9.2（3-CH）。以上数据与文献报道基本一致，推测化合物为狼毒乙素。化合物6：无色针晶，H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：5.35（1H，dd，

J

＝3.0，2.4 Hz，H-5），3.52（1H，tt，

J

＝10.8，4.2 Hz，H-3），1.00（3H，s，H-19），0.92（3H，d，

J

＝6.6 Hz，H-21），0.84（3H，t，

J

＝7.8 Hz，H-29），0.83（3H，d，

J

＝6.0 Hz，H-26），0.81（3H，d，

J

＝6.6 Hz，H-27），0.68（3H，s，H-18）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：140.8（C-5），121.7（C-6），71.8（C-3），56.8（C-14），56.1（C-17），45.9（C-24），42.3（C-4，13），39.8（C-12），37.3（C-1），36.5（C-10），36.2（C-20），33.7（C-22），31.9（C-7，8），31.7（C-2），29.2（C-25），28.3（C-23），26.1（C-16），24.3（C-15），23.1（C-28），21.1（C-11），19.8（C-26），19.4（C-19），19.1（C-27），18.8（C-21），12.0（C-29），11.9（C-18）。以上数据与文献报道基本一致，推测化合物为

β

-谷甾醇。化合物7：黄色油状，CHO，ESI-MS 的质核比（

m/z

）为285.20 [M-H]。H-NMR（600 MHz）

δ

：6.71（1H，s，H-1），5.87（dd，

J

＝10.8，17.4 Hz，H-15），4.89（1H，dd，

J

＝1.2，10.8 Hz，H-16），4.98（1H，dd，

J

＝1.2，17.4 Hz，H-16），2.69 ～2.59（2H，m，H-6），2.11（3H，s，H-19），1.98 ～1.95（2H，m，H-11），1.77 ～1.72（1H，s，H-8），1.67 ～1.54（2H，s，H-7），1.46 ～1.42（1H，m，H-14），1.21 ～1.18（1H，m，H-14），1.02（3H，s，H-17），1.00（3H，s，H-20）；C-NMR（150 MHZ，CDCl）

δ

：151.3（C-15），140.9（C-2），140.6（C-10），140.0（C-3），127.3（C-5），122.7（C-4），109.0（C-16），109.0（C-1），39.8（C-14），36.6（C-9），36.5（C-8），36.5（C-13），34.3（C-11），33.1（C-12），27.0（C-6），25.8（C-7），22.9（C-17），21.5（C-20），11.5（C-19）。以上数据与文献报道基本一致，推测化合物为euphebracteolatins A。化合物euphebracteolatins A 主要存在于月腺大戟中，首次在狼毒大戟中发现。化合物8：无色针晶，CHO，ESI-MS 的质核比（

m/z

）为289.21 [M-H]。H-NMR（600 MHz，CDCl）

δ

：5.89（1H，d，

J

＝1.2 Hz，H-3），5.80（1H，dd，

J

＝5.4，10.8 Hz，H-15），4.95（1H，d，

J

＝1.2 Hz，H-5），4.92（1H，dd，

J

＝1.2，3.6 Hz，H-16），4.90（1H，dd，

J

＝0.6，10.8 Hz，H-16），1.21（3H，s，H-18），1.20（3H，s，H-20），1.02（3H，s，H-17），0.69（3H，s，H-19）；C-NMR（150 MHz，CDCl）

δ

：183.9（C-2），173.3（C-4），150.0（C-15），117.3（C-3），109.5（C-16），89.9（C-5），43.3（C-7），41.0（C-14），39.6（C-10），39.4（C-8），39.4（C-9），39.1（C-6），36.0（C-13），31.7（C-12），30.0（C-20），28.5（C-11），22.6（C-17），18.9（C-19），18.8（C-18）。以上数据与文献报道基本一致，推测化合物为fischeria A。化合物9：白色针晶，CHO，ESI-MS 的质核比（

m/z

）为315.19 [M-H]。HNMR（600 MHz，CDCl）

δ

：5.47（1H，d，

J

＝5.4 Hz，H-11），3.71（1H，s，H-14），2.64（1H，d，

J

＝5.4 Hz，H-9），2.06（3H，s，H-17），0.95（3H，s，H-18），0.86（3H，s，H-19），0.73（3H，s，H-20）；CNMR（150 MHz，CDCl）

δ

：170.6（C-16），147.5（C-12），145.1（C-13），125.2（C-15），104.1（C-11），61.2（C-8），54.5（C-14），53.6（C-5），51.9（C-9），41.6（C-1），41.5（C-10），39.2（C-3），34.2（C-7），33.6（C-4），33.5（C-18），21.9（C-19），20.9（C-6），18.5（C-2），15.0（C-20），8.7（C-17）。以上数据与文献报道基本一致，推测化合物为岩大戟内酯A。

2.3 细胞毒活性实验

采用MTT 法对狼毒大戟中提取得到的9 个单体化合物进行细胞毒活性评价，选取6 种类型乳腺癌细胞株（Her 2 阳性型SKBr 3 及BT 474、LuminalA 型MCF-7、LuminalB 型ZR-75-1、三阴性乳腺癌MDA-MB-231 及Sum149）及1 种肝癌细胞株HepG2。以紫杉醇为阳性对照药。将上述7 种肿瘤细胞密度调整为5×10个·mL，接种到96 孔培养板中，每孔接种100 µL 细胞悬液，置于37 ℃、5%CO培养箱中培养过夜，观察细胞贴壁且生长良好后，设置阳性对照组，空白对照组和各个不同浓度药物的实验组。配制1 ～9 化合物的母液浓度为5 mmol·L，紫杉醇母液浓度为3.5 mmol·L，将各化合物和紫杉醇母液稀释得到8 个梯度浓度的样品溶液（20、15、12.5、10、7.5、5、2、1 mol·L，分别作用于7 种肿瘤细胞，空白对照组中加等量培养基，每个剂量样本设置6 个平行孔。分别置于37 ℃、5%CO培养箱中培养72 h，之后每孔加入MTT液（5 g·L）20 µL。继续培养4 h，吸弃上清液，每孔加入100 µL DMSO，避光，低速震荡15 min，使结晶充分溶解。用酶标仪（波长492 nm）测定吸光度（

OD

）值，计算不同浓度的化合物对乳腺癌细胞的抑制率。细胞抑制率（%）＝[1－（加药组

OD

值－调零孔

OD

值）/（对照组

OD

值－调零孔

OD

值）]×100%。由此计算阳性药紫杉醇及化合物1 ～9 对不同肿瘤细胞的抑制率，并确定72 h 半数抑制浓度，结果如表1、2，图2所示。

表1 9 个化合物对HepG2 和MCF-7 细胞生长的影响
Tab 1 Effect of 9 compounds on the growth of HepG2 and MCF-7 cells

注：“－”表示给药浓度＞100 µmol·L。
Note：“－” indicates that the administration concentration is more than 100 µmol·L.

化合物IC50/（µmol·L－1）HepG2MCF-7 1－－2 61.83±0.1165.73±0.74 3 54.55±0.07616.71±0.121 4－－5－－6－－25.55±0.02919.62±0.117 8－－7 9－－紫杉醇＜1＜1

图2 不同浓度的化合物2 和化合物3 对乳腺癌细胞株的抑制率Fig 2 Inhibition rate of compound 2 and compound 3 with different concentrations on the breast cancer cells

3 讨论

为了进一步探索狼毒大戟的化学成分和药理活性，本研究以中药材狼毒大戟饮片作为研究对象，应用多种色谱技术，从其乙醇总提物的乙酸乙酯萃取部位分离得到9 个单体化合物。通过化合物的理化性质、质谱及核磁数据，结合文献报道，分析鉴定了各单体化合物的化学结构。单体化合物涉及的结构类型有二萜类、三萜类、苯乙酮类、甾醇类，本研究已在SciFinder 中检索，确认化合物3 是新发现的化合物，化合物7 为首次从狼毒大戟中分离得到。

诸多学者对狼毒大戟的抗肿瘤活性进行了研究，结果表明其提取物及单体化合物对肝癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞等具有显著的抑制作用。本研究主要探索其狼毒大戟单体化合物对肝癌细胞和乳腺癌细胞的细胞毒活性。结果表明9 个单体化合物对肝癌细胞株HepG2 均无显著细胞毒活性。化合物2 对乳腺癌细胞株的细胞毒活性作用均显著，对乳腺癌细胞株BT474 的细胞毒活性效果最强，且其抑制效果呈浓度依赖性。化合物3 对乳腺癌细胞株Sum149、ZR-75-1 细胞毒活性明显，对乳腺癌细胞株Sum149 的细胞毒活性较乳腺癌细胞株ZR-75-1 强。化合物7 对乳腺癌MCF-7 细胞有一定抑制作用。其他化合物对乳腺癌细胞株未表现出显著抑制活性。

化合物3 的抗乳腺癌细胞毒活性与化合物2相比发生明显变化，其对乳腺癌细胞株ZR-75-1细胞毒活性较化合物2 弱，而对Sum149 细胞的细胞毒活性较化合物2 强，且对其他乳腺癌细胞株均无明显的细胞毒活性。化合物3 结构较化合物2 在5'位上少了一个甲基，从化合物构效关系上来看，化合物2 结构中5'位上甲基对化合物的活性具有显著影响。明确化合物的构效关系有利于进一步探索化合物对肿瘤细胞毒性的作用机制。

综上，尽管相关学者对狼毒大戟进行了大量研究，但针对其化学成分及活性的研究仍然是目前开发应用的热点。本研究进一步分析狼毒大戟的化学成分，筛选其单体化合物对肝癌细胞和乳腺癌细胞株的细胞毒活性，并初步探讨其活性化合物的构效关系，为深入开发狼毒大戟的中药资源和临床应用提供参考。

表2 3 个化合物对乳腺癌细胞生长的影响
Tab 2 Effect of 3 compounds on the growth of the breast cancer cells

注：“20（30%）”表示给药浓度20 µmol·L 时抑制率为30%。
Note：“20（30%）” indicates that the inhibition rate is 30% when the administration concentration is 20 µmol·L.

化合物IC50/（µmol·L－1）MDA-MB-231Sum149MCF-7ZR-75-1SKBr3BT474 2 5.41±0.265.47±0.17 5.73±0.74 3.49±0.5410.10±1.662.63±0.59 3 12.55±0.395.23±0.4416.71±0.1210.13±1.8013.69±2.67＞20（40%）5＞20（30%）＞20（30%）＞20（30%）＞20（30%）＞20（30%）＞20（30%）紫杉醇1.72±0.092＜1＜11.89±0.110＜1＜1