基于网络药理学探讨水红花子抗肝硬化机制

杨涵， 崔银峰， 范忠义， 朴燕， 张昌浩， 金莉莉

( 延边大学 药学院， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

肝硬化(liver cirrhosis， LC)是坏死肝脏纤维组织弥漫性增生而导致肝脏的正常结构遭到破坏的一种疾病[1].目前，肝硬化的发病机制尚不明确，西医对其治疗仍不理想.近年来一些学者采用传统中医治疗肝硬化取得了一定疗效[2-4].临床研究[5-6]显示，水红花子(Fructuspolygoniorientalis)可用于治疗胃脘胀痛、散血消淤、消积止痛等，且对慢性肝炎、肝硬化以及肝纤维化等也有一定的治疗效果.基于此，本文基于系统生物学理论，利用网络药理学和分子对接方法探讨水红花子治疗肝硬化的作用机制，并通过构建药物 - 靶点- 疾病网络对其进行系统的网络分析，进而对药物作用的机制进行预测，以期为水红花子治疗肝硬化提供理论依据和临床参考.

1 实验方法

1.1 水红花子治疗肝硬化的网络药理学研究的基本思路

水红花子治疗肝硬化的网络药理学研究的基本思路见图1，具体为：①利用TCMSP数据库对水红花子的活性成分进行筛选；②利用Uniprot数据库对水红花子活性成分的基因进行注释，以此获得水红花子活性成分的靶点基因名；③利用GeneCards数据库筛选出肝硬化的靶点基因；④在获得水红花子与肝硬化交集基因的基础上，利用Cytoscape 3.8.0软件和String数据库构建水红花子有效成分 - 肝硬化的靶点基因网络、蛋白质相互作用网络；⑤利用DAVID数据库对水红花子与肝硬化的交集基因进行GO与KEGG富集分析；⑥利用AutoDock Vina 1.1.2软件对水红花子有效成分的配体小分子与受体蛋白的分子进行对接.

图1 水红花子治疗肝硬化的网络药理学研究的思路图

1.2 水红花子活性成分与候选靶点的收集

TCMSP数据库(http://tcmspw.com/)是中药系统药理学数据库和分析平台，可用于分析药物、靶标和疾病之间的关系.在TCMSP数据库中的“Herb name”项中输入“水红花子”进行检索即可在“Latin name”项中获得水红花子所有活性成分的信息.文献[7-8]研究表明，对药物的口服生物利用度(OB)和类药性(DL)进行评估有助于优化药代动力学和药物性质.因此本文以生物利用度和类药性作为评价基准，筛选出OB≥30%且DL≥0.18[9]的水红花子活性成分，并将其对应的潜在靶点作为候选靶点.

按上述条件筛选后，在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中的“UniProtKB”项中检索水红花子活性成分的靶点蛋白名称(限定物种为人“Homo sapiens”)，以此校正上述候选靶点所对应的基因名.

1.3 肝硬化相关基因、水红花子与肝硬化交集基因的筛选

首先，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中检索与肝硬化相关的靶基因，并筛选出符合“Relevance score ≥10”条件的与肝硬化相关的基因.然后，利用Venny 2.1.0平台获取水红花子有效成分与肝硬化的交集基因.交集基因中的水红花子活性成分均有可能是治疗肝硬化的有效成分.

1.4 水红花子有效成分 肝硬化的靶点基因网络与蛋白质相互作用网络的构建

首先利用Cytoscape 3.8.0软件建立水红花子有效成分-肝硬化的靶点基因网络，然后利用“Tools”项中的“Analyze Network”对该网络进行可视化分析，最后通过编排degree值筛选出水红花子治疗肝硬化的主要作用靶点.

将水红花子与肝硬化的交集基因导入String数据库(https://string - db.org/)，以此获取蛋白质的相互作用信息，最后导入Cytoscape 3.8.0软件构建蛋白质间的相互作用网络.

1.5 水红花子对肝硬化相关靶点的GO与KEGG富集分析

将水红花子与肝硬化的交集基因导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)中，然后通过选择“OFFICIAL - GENE SYMBOL”项中的基因列表(限定物种为人“Homo sapiens”)对其进行GO与KEGG富集分析.

1.6 水红花子对肝硬化相关靶点的分子对接验证

首先在TCMSP数据库中检索并下载水红花子治疗肝硬化的5种有效成分(β- 谷甾醇、山奈酚、儿茶素、圣草酚、槲皮素)的分子结构(mol2格式)，然后在RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中获取上述5种成分所对应的6个靶点(IL - 6、VEGFA、AKT1、TP53、CXCL8、TNF)的3D分子结构(pdb格式)，最后利用AutoDock Vina 1.1.2 软件对配体小分子与受体蛋白进行分子对接.

2 结果与分析

2.1 水红花子活性成分与作用靶点的收集

在TCMSP数据库中共筛选出10个水红花子的活性成分(见表1)和与其对应的340个潜在靶点.

表1 水红花子的活性成分

2.2 肝硬化相关基因、水红花子与肝硬化交集基因的筛选结果

利用GeneCards数据库共筛选出284个与肝硬化相关的靶基因.利用Venny 2.1.0平台共筛选出39个水红花子与肝硬化靶点基因的交集基因，如图2所示.

图2 水红花子与肝硬化的靶点基因Venn图

2.3 水红花子有效成分肝硬化的靶点基因网络与蛋白质相互作用网络的构建结果

水红花子与肝硬化的交集基因对应水红花子中的6种化合物，分别是金圣草黄素、β- 谷甾醇、山奈酚、儿茶素、圣草酚、槲皮素.水红花子有效成分 - 肝硬化的靶点基因网络如图3所示.由图可以看出， 6种化合物中槲皮素(degree值为20)和山奈酚(degree值为 14)对治疗肝硬化具有较好的药效.但考虑水红花子中的金圣草黄素含量极少，其对疾病的治疗效果较低，因此推断水红花子治疗肝硬化的有效成分可能是β-谷甾醇、山奈酚、儿茶素、圣草酚、槲皮素.

图3 水红花子有效成分肝硬化的靶点基因网络图(蓝色代表水红花子有效成分，玫红色代表靶点)

图4为水红花子治疗肝硬化的蛋白质相互作用网络图，图中节点代表蛋白(共有39个靶基因节点(node))，边代表蛋白质间的相互作用关系(共有440条边(edge)).degree值越大表示该蛋白在网络中发挥的作用越大，节点颜色越深表示节点间的相互作用越强.根据degree值选取出的前6位靶点分别是IL - 6、VEGFA、AKT1、TP53、CXCL8、TNF.研究显示，AKT2[10]、PI3K/Akt1[11]、TNF -α[12]、IL - 1β[13]是参与肝纤维化形成过程中的重要细胞因子，因此可推测水红花子可能通过上述靶点发挥了其治疗肝硬化的作用.

图4 蛋白质间相互作用的网络图

2.4 水红花子对肝硬化相关靶点的GO与KEGG富集分析结果

GO富集包括生物过程(biological process， BP)、细胞组分(cellular component， CC)、分子功能(molecular function， MF).研究[14]显示，数据中错误发现率(FDR)小于0.05即表示该数据具有显著性，因此本文选用P<0.05和FDR<0.05作为水红花子对肝硬化相关靶点进行GO和KEGG富集分析的判定基准.取BP过程的前14条条目、CC过程的3条条目、MF过程的3条条目进行GO富集分析，结果见图5.由图5可知，水红花子治疗肝硬化所涉及的生物过程可能包括凋亡负调控、程序性细胞死亡负调控、细胞增殖调控等，细胞组分可能包括细胞外间隙、胞外区部分等，分子功能可能包括细胞因子活性、血红素结合、四吡咯结合等.

图5 水红花子对肝硬化相关靶点的GO分析气泡图

按上述筛选条件(P<0.05和FDR<0.05)在水红花子与肝硬化的交集基因中共筛选出7条水红花子治疗肝硬化相关的信号通路，见图6.由图可以看出，水红花子治疗肝硬化的相关信号通路可能有癌症通路、细胞因子- 细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路等.

图6 水红花子对肝硬化相关靶点的KEGG富集分析气泡图

2.5 水红花子对肝硬化相关靶点的分子对接验证结果

本文研究结果显示，水红花子有效成分与肝硬化相关靶蛋白的结合能小于-5.0 kcal/mol时可使配体小分子与受体蛋白较好地结合，且结合能越小其结合得越好.该结果与文献[15-16]的研究结果一致.水红花子的有效成分和靶蛋白的结合能见表2.由表2可以看出，槲皮素、儿茶素、山奈酚、圣草酚、β-谷甾醇分别与IL - 6、VEGFA、AKT1、TP53、CXCL8、TNF这6个靶点蛋白的结合能均小于-5.0 kcal/mol，说明它们之间均具有较好的结合活性.另有研究[17]显示，银杏叶中的活性成分槲皮素、山奈酚与受体蛋白AKT1的结合能和临床推荐用药呋塞米与受体蛋白AKT1的结合能相近.由以上分子对接结果及文献[17]可推断，水红花子对肝硬化具有一定的治疗效果.另外，文献[18-27]也证实了上述5种有效成分具有保肝作用.

表2 水红花子有效成分与靶蛋白的结合能

3 结论

本文利用网络药理学和分子对接对水红花子抗肝硬化机制进行了研究，初步探讨了水红花子治疗肝硬化的有效成分、作用靶点以及相关的生物学过程和相关信号转导通路.研究结果显示水红花子治疗肝硬化是通过多成分、多靶点、多通路来发挥药效的，该研究结果可对后续深入研究水红花子抗肝硬化机制提供参考.目前，利用网络药理学研究中药对疾病的治疗机制仍存在一定的局限性，如受现有疾病数据库对疾病基因的收录不全等原因，因此本文的研究结果还需与临床及药理试验相结合.