褪黑素对IL-1β/TNF-α诱导终板软骨细胞黏附减少的作用和机制

全惠琳，郇 宇，胡学昱

(空军军医大学西京医院：1骨科，2神经外科，陕西 西安 710032)

下腰痛是骨科最常见的疾病之一，该病常常影响患者的生活和工作，治疗棘手且花费巨大[1]。椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)作为下腰痛最主要的病因之一[2]，其致病因素尚不明确，缺乏有效的治疗措施且目前无法根治。椎间盘作为脊柱单元中重要的承受力结构，由中心的髓核(nucleus pulposus，NP)、外围的纤维环(annulus fibrosus，AF)和终板软骨(cartilage endplate，CEP)共同组成“夹心饼干”样结构[3]。大量研究表明CEP是椎间盘的营养运输路径，是IDD重要的治疗靶点。软骨细胞是CEP的主要细胞类型，包埋在细胞外基质中，由胞膜的整合素家族蛋白(尤其是整合素β1)与细胞外基质的配体(如纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、Ⅱ型胶原等)介导细胞与细胞外基质连接[48]，其中Ⅱ型胶原是CEP细胞外基质的主要成分之一[910]，可能是CEP退变中结合整合素的重要角色。CEP退变与吸烟、异常生物力学负荷、感染等因素相关[1]，在IDD过程中外周血管入侵CEP，促进IL-6、IL-8、TNF-α等因子释放[1112]，已被认为是导致IDD最主要的损伤因素之一。但是，这些细胞因子导致CEP退变的机制尚不可知。因此探索炎性因子诱导CEP退变的发病机制、寻求潜在治疗手段势在必行。褪黑素具有抑制椎间盘炎症的功能，可以促进IL-1β和TNF-α诱导的退变NP细胞的细胞外基质合成，抑制NP细胞凋亡[1314]，但具体机制仍在探索阶段，而且褪黑素对CEP细胞与细胞外基质的相互作用影响方面也缺乏相关研究。本研究拟从细胞与细胞外基质相互作用的角度出发，探讨褪黑素对IL-1β/TNF-α诱导CEP退变的治疗作用和机制 。

1 材料与方法

1.1 材料

整合素β1(sc-374429，Santa Cruz Biotechnology，美国)；Ⅱ型胶原(ab34712，Abcam，英国)；β-actin(66009-1-Ig，Proteintech，美国)；ki67(ab15580，ab16667，Abcam，英国)；Western blotting 二抗(7076，7074，CST，美国)；荧光二抗(Alexa Fluor 488/594，Invitrogen，美国)；细胞黏附检测试剂盒(HR8260，北京百奥莱博科技有限公司，中国)；纤维粘连蛋白(F2006，Sigma，美国)；DMEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；青链霉素混合液(Servicebio，中国)；软骨细胞生长因子(Sciencell，美国)；2.5 g/L胰蛋白酶(Hyclone，美国)；0.2 g/L Ⅱ型胶原酶(Sigma，美国)；甲苯胺蓝染液(北京索莱宝科技有限公司，中国)。4周龄雄性C57小鼠购自空军军医大学实验动物中心，实验经空军军医大学动物伦理委员会批准(许可证号：IACUC-20200651)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代CEP细胞培养 实验选用4周龄雄性C57小鼠，提取L1～L6 CEP组织，用软骨细胞专用完全培养基，按组织块培养法常规培养。置于37 ℃，50 mL/L CO2的培养箱中，每周换液1次。当细胞融合度达到80%～85%时传代(P0)，传代至P3后进行后续实验。

1.2.2 小鼠原代CEP细胞鉴定 将小鼠原代CEP细胞进行爬片后，滴加甲苯胺蓝染液染色5 min，滴加等量蒸馏水混匀染色15 min，倒掉染液，谨慎吸取多余染液后进行镜检。

1.2.3 免疫荧光检测 将细胞爬片用PBS洗3次，每次3 min；用40 mL/L多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，每次3 min；5 mL/L Triton X-100室温孵育20 min，PBS洗3次，每次3 min；吸水纸吸干液体，10 mL/L BSA封闭30 min，吸水纸吸去封闭液，不洗；每张载玻片滴加稀释好的一抗放入湿盒，4 ℃孵育过夜。用PBST清洗爬片3次，每次3 min；吸水纸吸去多余液体后滴加稀释好的二抗，20～37 ℃孵育1 h，用PBST洗3次，每次3 min。滴加DAPI避光孵育5 min，PBST洗4次，每次5 min，吸水纸吸去液体，用抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.4 实验分组 实验分组包括对照组(无处理)、炎症诱导组(10 μg/L IL-1β+10 μg/L TNF-α)[1517]、褪黑素对照组(2 μmol/L褪黑素)、褪黑素组(10 μg/L IL-1β+10 μg/L TNF-α + 2 μmol/L褪黑素)[1718]。

1.2.5 Western blotting检测 取各组细胞加入RIPA裂解液裂解30 min，12 000 r/min离心30 min取上清，用BCA法定量检测蛋白质，煮沸上样，每孔加40 μg，经120 mL/L SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，脱脂奶粉封闭1 h，加入稀释的一抗过夜，TBST缓冲液洗膜，二抗室温孵育2 h，TBST缓冲液洗膜后发光显影。

1.2.6 细胞黏附检测 96孔板每孔加入100 μL Fibronectin包被，将培养板置于2～8 ℃条件下过夜。移除包被液，洗涤液洗涤2次。4组细胞用胰酶消化，PBS洗涤2次，完全培养基重悬，按5×104个/孔接种，设立对照组(不弃上清)。37 ℃孵箱孵育40 min。取出培养板，吸去培养基。完全培养基洗涤3次，每孔加入100 μL完全培养基后再加入10 μL细胞染液，37 ℃孵育2 h后行细胞黏附检测。

2 结果

2.1 小鼠原代CEP细胞鉴定

小鼠原代CEP细胞由组织块缓慢爬出，逐渐布满瓶底。生长密集的地方，细胞呈铺路石样聚集，较稀疏的地方呈梭型。经甲苯胺蓝染色，可见胞质呈现蓝紫色，而胞核呈现较深的蓝色。Ⅱ型胶原是常规鉴定软骨细胞的方法，荧光显微镜下可见软骨细胞的胞质呈绿色，而胞核不着色(图1)。

A：小鼠CEP细胞；B：小鼠CEP细胞甲苯胺蓝染色；C：小鼠CEP细胞Ⅱ型胶原免疫荧光染色；D：小鼠CEP细胞Ⅱ型胶原DAPI染色；E：小鼠CEP细胞Ⅱ型胶原染色混合图。标尺为20 μm。CEP：终板软骨。图1 小鼠原代CEP细胞鉴定

2.2 褪黑素逆转炎性环境对软骨细胞整合素β1和Ⅱ型胶原表达的抑制作用

对照组中，Ⅱ型胶原染色可见软骨细胞胞浆着亮绿色，形态饱满，胞核不着色。但是在炎症诱导组中，软骨细胞周围的Ⅱ型胶原分泌减少，分布稀疏。经过统计发现，在炎性环境中，Ⅱ型胶原相对荧光强度降低(炎症诱导组vs对照组：22.21vs41.54，P<0.01，图2A～B)。此外，炎症诱导组整合素β1的荧光强度同样减弱(炎症诱导组vs对照组：2.54vs8.20，P<0.01，图2C～D)。经过Western blotting检测显示相同的结果，炎症诱导组的整合素β1(炎症诱导组vs对照组：0.48vs1.06，P<0.01)和Ⅱ型胶原(炎症诱导组vs对照组：0.81vs1.02，P<0.01)的表达显著下降(图2E～G)。上述结果提示，可能是炎性环境影响了软骨细胞的功能，使细胞膜表面的整合素β1表达减少，同时自身分泌Ⅱ型胶原的能力减弱。已有文献证明褪黑素可以改善退变椎间盘NP的炎性环境[19]，但是对CEP的作用尚不明确。因此，使用褪黑素刺激软骨细胞，经过Western blotting检测发现，虽然对照组和褪黑素对照组之间的作用无统计学差异，但是褪黑素可以缓解IL-1β和TNF-α诱导的软骨细胞功能的降低，在炎症诱导基础上上调整合素β1(炎症诱导组vs褪黑素组：0.48vs0.79，P<0.01)和Ⅱ型胶原(炎症诱导组vs褪黑素组：0.81vs0.94，P<0.01)的表达(图2E～G)。

A：Ⅱ型胶原免疫荧光图(标尺为20 μm)；B：Ⅱ型胶原相对荧光强度统计图；C：整合素β1免疫荧光图(标尺为100 μm)；D：整合素β1相对荧光强度统计图；E：Ⅱ型胶原和整合素β1 Western blotting检测图；F～G：Ⅱ型胶原和整合素β1的Western blotting检测统计图。bP<0.01。图2 褪黑素逆转炎性环境对软骨细胞整合素β1和Ⅱ型胶原表达的抑制

2.3 褪黑素促进软骨细胞增殖及其与细胞外基质的黏附

ki67的免疫荧光结果显示，炎症诱导组ki67阳性细胞数相较于对照组显著降低(炎症诱导组vs对照组：0.19%vs0.82%，P<0.01，图3)。

A：ki67免疫荧光图(标尺为20 μm)；B：ki67阳性细胞数统计图。bP<0.01。图3 褪黑素促进软骨细胞增殖

同时通过Western blotting检测，我们发现ki67的表达水平也显著降低(炎症诱导组vs对照组：0.41vs1.06，P<0.01)，与免疫荧光结果相符合，结果证明炎性环境中的软骨细胞增殖能力减弱(图4A～B)。在细胞黏附能力检测中发现，炎症诱导组中细胞黏附率明显下降(炎症诱导组vs对照组：0.90%vs1.43%，P<0.01，图4C)，揭示了炎性环境可以使细胞和细胞外基质的黏附能力减弱。此外，我们发现褪黑素除了可以上调整合素β1和II型胶原表达外，还可以促进软骨细胞增殖(炎症诱导组vs褪黑素组：0.41vs0.86，P<0.01)和黏附(炎症诱导组vs褪黑素组：0.90%vs1.06%，P<0.01，图4A～C)。

A：ki67 Western blotting检测图；B：ki67 Western blotting检测统计图；C：细胞黏附率统计图。aP<0.05，bP<0.01。图4 褪黑素促进软骨细胞增殖及其与细胞外基质的黏附

3 讨论

IDD是困扰人们生活、工作的最常见骨科疾病，具有发病率高、治疗手段有限且周期长等特点。其治疗主要依赖药物和手术[19]，不仅会产生高昂的治疗费用[20]，而且无法从根源上解决这一难题。因此，探索IDD的病因成为目前亟待解决的临床热点问题。目前学者们将目光聚焦于NP的研究上，与之相比，针对CEP的研究十分稀缺。而CEP作为椎间盘的受力结构和物质运输的承担者，在IDD的发生与进展中意义重大。在生理状态下CEP无血管分布，但是退变的CEP伴随外周血管的入侵，促进IL-6、IL-8、TNF-α等因子释放[1112,21]加速IDD的恶化。

健康软骨细胞包埋在细胞外基质中，并与细胞外基质紧密连接；当内环境失衡时，软骨细胞的细胞外基质降解，二者间的黏附能力降低。整合素主要由α和β亚基组成，广泛存在于哺乳动物的细胞中[5]。其中，整合素β1被证实在软骨细胞中发挥主要作用，可以与细胞外基质的配体共同介导细胞黏附[5,9,2223]。Ⅱ型胶原作为软骨细胞细胞外基质的主要成分之一，可以同整合素β1结合介导软骨细胞黏附，共同维持软骨细胞的生理功能和活性。相关研究表明炎性环境会破坏关节软骨细胞外基质，促进其降解[2426]，进而促使细胞外基质中的Ⅱ型胶原的表达下调。此外，整合素β1的表达水平也会受到炎症环境的干扰，二者均影响软骨细胞功能与状态[4,6,16,24,27]。但是我们尚不清楚退变CEP细胞与细胞外基质成分是否同样受炎症环境影响。因此，在本研究中，我们分离培养了小鼠原代CEP细胞，证实培养的细胞为软骨细胞后，根据文献[16]选用IL-1β和TNF-α模拟炎性环境，进行了免疫荧光和Western blotting检测，结果发现，经过IL-1β和TNF-α刺激后的细胞Ⅱ型胶原和整合素β1的表达下调。为了探索Ⅱ型胶原和整合素β1的低表达是否会干扰CEP细胞与细胞外基质的黏附，我们又检测了小鼠原代CEP细胞的黏附能力，结果发现，IL-1β和TNF-α的刺激确实会弱化细胞的黏附能力。同时经过ki67的染色发现，IL-1β和TNF-α降低了小鼠原代CEP细胞的增殖能力。上述结果说明，炎性环境会改变CEP细胞和细胞外基质的黏附能力和活力。

褪黑素是一种主要由松果体分泌的激素[28]，其通过缓解炎性环境对IDD和骨关节炎均有明显的治疗作用[1718,29]。在关节软骨的研究中，褪黑素被证明可以抑制关节软骨IL-1β和TNF-α等促炎因子的表达[2933]。经文献证明，褪黑素在CEP中也发挥着类似的作用。褪黑素可以降低LPS刺激的感染模型CEP细胞中IL-1β的水平，抑制细胞外基质的降解，上调Ⅱ型胶原的表达。同时通过影像学和组织学评分证明褪黑素能够延缓IDD小鼠CEP退变的进展[34]。不同的是，本研究使用IL-1β和TNF-α在体外模拟CEP退变中的细胞因子浸润环境。并且在此基础上，对降解的细胞外基质与CEP细胞的相互作用(黏附)进行探讨，并在小鼠原代CEP细胞上进行了褪黑素对炎症诱导的CEP退变细胞黏附作用的研究。经过Western blotting检测，证明褪黑素组可以减缓IL-1β和TNF-α造成的细胞整合素β1和Ⅱ型胶原的低表达，加强细胞的黏附和增殖能力。这些结论均为褪黑素治疗CEP退变提供了理论支持。

虽然IL-1β和TNF-α均有促炎作用，但是二者促进CEP退变的程度值得后续探索。有研究证明，分别使用IL-1β和TNF-α刺激正常人的原代关节软骨细胞，结果发现与IL-1β相比，TNF-α对软骨细胞的损伤更加严重[35]。而本实验证实了二者的联合应用可以诱导CEP细胞退变，然而IL-1β或TNF-α哪一方的作用占主导尚不能知晓。同理，褪黑素虽然可以抑制IL-1β和TNF-α导致的CEP细胞退变，但是褪黑素主要通过抑制IL-1β或TNF-α发挥保护作用的结论也不明确。普遍观点认为褪黑素在不同疾病中均发挥抑制炎症的作用[18,28]，也有证据表明褪黑素对TNF-α刺激的细胞损伤有更大的保护作用，而对于IL-1β刺激的细胞效果不佳[36]。这些结论提示在CEP细胞退变中，IL-1β和TNF-α对CEP细胞的损伤可能不同，IL-1β和TNF-α对褪黑素的敏感度也可能存在差异，这些差异都将作为后续实验的关注点。

综上所述，本研究证明IL-1β和TNF-α会使CEP细胞的整合素β1和Ⅱ型胶原表达减少，同时抑制细胞增殖及黏附能力。而褪黑素可以减轻这些病理改变，上调其表达，增强细胞的增殖与黏附。虽然本研究内容有限，但从细胞黏附的角度探讨了炎性环境与CEP退变的关系，并丰富了褪黑素可以治疗CEP退变的证据。后续将针对IL-1β和TNF-α二者导致CEP退变的机制及其对褪黑素的敏感度进行更深入的研究，探索褪黑素抑制CEP退变的具体机制，为治疗IDD提供新的思路。