千里香离体再生体系的建立

罗艺，杨淦麟，谭嘉娜，陈月桂，罗剑飘，杨俊贤

（1.广东省科学院南繁种业研究所湛江研究中心，广东 湛江 524300；2.崇左市江州区农业技术推广站，广西 崇左 532200）

【研究意义】千里香（Murraya paniculata）是一种芸香科九里香属小乔木或灌木的药用植物，主要生于疏林或干燥的坡地中，大多分布于广东、海南、广西、湖南、福建等华南以及西南地区［1］，属于热带亚热带植物［2］。千里香具有行气止痛、活血散瘀、降血糖、抗生育以及抗肿瘤等多种功效，有利于治疗感冒、风湿骨痛、胃痛和跌打肿痛等症状［3-6］，是中成药的主要原料之一，近年来市场需求量逐年增加。目前千里香繁殖的主要方法为自然播种繁殖，但在野生状态下难以开花，致使种子数量少［7］，且种子的萌发成功率较低，种子萌动前的贮藏天数较多，完成萌发过程需要较长时间，部分种子存在休眠状态［8］，经过自然播种达到的丛芽繁殖系数与生根率较小，难以满足大面积生产种植需求。构建千里香离体再生繁殖体系，可满足千里香种植的种苗需求，为我国三九集团等药企提供可靠的原材料及提供技术保障。

【前人研究进展】近十几年来，关于千里香化学成分和药理方面的研究较多。从千里香中分离鉴定出黄酮类化合物、生物碱、香豆素等物质，发现千里香含有的磷脂酶A 抑制剂能够治疗蛇毒引起的肌肉损伤［9-10］；叶片的乙醇提取物具有镇痛作用［11］；《中国植物信息》记载千里香的根还可用作口腔黏膜表皮的麻醉剂；提取的挥发油也具有抗炎镇痛的作用［12］。这些化合物的发现为千里香的药用价值和应用提供了新的思路［13-16］。在千里香种苗繁育方面，蒋健林等以四数九里香种子为材料研究种子萌发，使用最佳的IBA激素处理萌芽率只能达50%［17］。千里香在诱根方面存在生根数较少和生根率较低的问题，蒋烨用千里香无菌苗进行生根培养，结果表明千里香的出根数和生根率都低［7］。由此可知，千里香的高效繁殖有待进一步提高。

【本研究切入点】以千里香成熟种子所诱导的丛生芽作为增殖材料，利用植物离体培养技术繁殖速度快、系数高的优点，筛选出种子萌发、增殖、壮苗、生根等阶段适宜的培养基配方，以解决其种苗大量增殖与生根的问题，建立千里香离体再生体系。【拟解决的关键问题】本研究利用植物生长调节剂及不同培养基种类，对其再生体系建立的各环节进行探索优化，以期获得高效的离体再生体系，为千里香组培种苗的工厂化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料千里香种子由三九集团提供，试验于2021 年9 月至2022 年5 月在广东省科学院南繁种业研究所湛江研究中心完成。成熟千里香果实的果皮为黄绿色或者黄褐色，按照果实种子含胚数可分为单胚果实和双胚果实，本试验使用的是单胚果实的种子。挑选形状大小一致、籽粒饱满的种子进行预处理。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理 外植体处理：在超净工作台中，种子用75%酒精处理30 s，无菌水冲洗2 次，再用0.1%升汞处理10 min，无菌水冲洗5 次，用无菌滤纸吸干水分，种子剥去种皮，接种于萌发培养基上。置于组织培养室进行培养，培养温度为23（±2）℃，平均光照强度为1 200 lx 左右，光照时间10 h/d。

试验培养基中蔗糖均为30 g/L，卡拉胶7.0 g/L，pH 值在5.8～6.2。马铃薯汁配制方法：市售马铃薯，削皮，切块，称取200 g 煮软，使用榨汁机榨成汁液，加水定容至1 L 配制成200 g/L 浓度。香蕉汁配制方法：市售香蕉，剥皮，称取200 g 香蕉加水榨汁，加水定容至1 L 配制成200 g/L 浓度。

1.2.2 种子萌发培养基的筛选 以MS 为基本培养基，设置5 种培养基（表1）进行种子萌发的诱导试验。统计萌发率，获得适宜种子萌发的培养基。

1.2.3 增殖与壮苗基本培养基筛选 根据千里香种胚在芽诱导培养基的发芽情况，分别设置3/2MS、MS、3/4MS、1/2MS 4 种培养基（表2）进行比较试验。每种培养基接种4 瓶，每瓶接种6 丛。每3 d 观察一次生长情况，40 d 后观测生长势、色泽、茎粗、落叶、褐化和死亡等指标。

1.2.4 增殖培养基的筛选 以1.2.3 筛选的最佳培养基为基本培养基，添加不同浓度6-BA、NAA和IBA（表3）。将诱导的无菌芽苗顶芽或带腋芽的茎段作为增殖材料，接种到增殖培养基上，每个培养基配方接种4 瓶，每瓶接种6 株种苗，每株种苗带有2～3 个丛生芽。40 d 后统计增殖系数（增殖系数=新增殖苗数/接种苗数）与生长势、色泽、茎粗、落叶、褐化和死亡等指标。

1.2.5 壮苗培养基的筛选 以1.2.3 筛选的最佳培养基为基本培养基，通过添加马铃薯汁和香蕉汁进行生根前的壮苗培养，将增殖培养获得的丛芽分6 个处理组合（表4），每个处理接种3 瓶，每瓶接种6 丛。40 d 后观察生长状况和测量植株增长高度，筛选出最适宜的壮苗培养基。

1.2.6 生根培养基的筛选 以1/2MS 为基本培养基，添加活性炭0.1 g/L，分别添加不同浓度IBA、NAA、IBA+NAA，设置15 个处理（表5）。挑选生长一致的芽苗，切除基部及近基部1～2 片叶子，切取长度为2 cm 左右、生长健壮的不定芽进行生根培养。每个处理接种4 瓶，每瓶接种6 株。40 d 后统计生根率［生根率（%）=（生根的组培苗数/接种苗数）×100］。

根据以上生根结果对生根培养基进行优化，分别设置不同激素浓度IBA、IBA 与NAA 组合，并添加马铃薯汁与香蕉汁进行提纯复壮（表6）。每个处理接种3 瓶，每瓶接种6 株丛苗。40 d 后计算生根率。

1.2.7 炼苗移栽 将生根良好健壮的植株移到温室中进行闭瓶炼苗2～3 d。用镊子夹出，清洗根部的培养基，在植株水分蒸腾量处于较低水平时移植，将其移栽至泥炭土∶黄心土∶珍珠岩∶钙镁磷肥（3∶2∶1∶0.2）的混合基质中，洒上浓度0.4 mg/L 的生根水使其定根［17］，观察统计成活率［成活率(%)=（成活的移栽苗数量/总移栽数量）×100］和苗的生长状况。

试验数据采用Excel 进行方差分析，F测验显著后使用新复极差法（SSR）进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 种子萌发培养基的筛选

由表1 可知，MS+0.5 mg/L 6-BA 和MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA 培养基种子萌发速度最快，萌发率最高。为节约成本，本试验筛选出最适合种子萌发的培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L，萌发率可达62.5%。

表1 不同培养基种子培养24 d 后的萌发率Table 1 Germination rates of seeds cultured in different media for 24 d

2.2 增殖与壮苗基本培养基的筛选

由表2 可知，MS 培养基的增殖系数最高，生长势较好，表现最佳，1/2MS 培养基生长势一般，3/4MS 培养基表现较差，而3/2MS 培养基出现落叶、褐化和死亡的现象，与其他3 种培养基相比，MS 培养基组培苗生长状态最好。

表2 千里香在不同基本培养基中的生长状况Table 2 Growth of Murraya paniculata in different basic media

2.3 增殖培养基的筛选

由表3可知，在培养基MS添加6-BA+NAA不同配比中，培养基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L的丛生芽增殖系数达到2.37，生长势较好，茎秆较粗，芽苗健壮，叶片多且大。培养基MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.2 mg/L 增殖系数出现下降的情况，继续加大6-BA 和NAA 浓度，增殖系数逐渐提高但其组培苗的生长势一般，黄叶多且叶片稀疏。培养基6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.40 mg/L 芽苗的增殖系数急降，生长势弱且出现死亡现象。在培养基MS 添加6-BA+IBA 不同配比中，其组培苗增殖系数相对比添加同浓度6-BA+NAA 培养基的增殖系数低，所有处理增殖系数<2，其中培养基MS+6-BA 0.8 mg/L+IBA 0.30 mg/L 的增殖系数最低，仅为1.01，生长势也一般，可知添加IBA 对千里香的增殖效果比NAA 差。对处理间增殖系数进行方差分析表明，各处理间的增殖系数差异显著。因此，筛选出千里香增殖适宜培养基为MS +6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L。

表3 不同6-BA、NAA 与IBA 激素水平配比对增殖的效应Table 3 Effects of different ratios of 6-BA,NAA and IBA on proliferation

2.4 壮苗培养基的筛选

如表4 所示，培养基中添加有机物马铃薯汁的浓度在20 g/L 时，组培苗的生长速度最快，植株增长高度大于1 cm，但叶色偏黄，叶片少，茎秆较细，出现叶子掉落现象。添加马铃薯汁30 g/L 培养基中组培苗长势较好，植株高度0.93 cm，叶子较浓密，叶片大，茎秆粗壮挺直，且与马铃薯汁浓度为20 g/L 相比两组处理间差异不显著。培养基中添加有机物香蕉汁的浓度为20 g/L 时，组培苗的生长速度最快，但植株生长表现和增长高度不如添加马铃薯汁20 g/L 和30 g/L处理，且植株增长高度对比达到显著差异。因此筛选出千里香最佳壮苗培养基配方为MS+马铃薯汁30 g/L。

表4 马铃薯汁与香蕉汁对千里香壮苗的效应Table 4 Effects of potato juice and banana juice on strong seedlings of Murraya paniculata

2.5 生根培养基的筛选

由表5 可知，添加IBA 的培养基中，生根条数最多的培养基配方为1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+活性炭 0.1 g/L，生根率为25.0%，但无愈伤组织产生；添加NAA 的培养基中，各处理均有愈伤组织产生，但生根效果不理想，其中添加NAA 0.8、1.0 mg/L的培养基中无根系产生，且出现黄叶现象，表明添加NAA 对生根的效果不理想；添加IBA+NAA不同配比的培养基中，IBA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L 配比生根率最高，但仅为12.5%，愈伤组织也极少。

表5 不同浓度IBA、NAA、IBA+NAA 对生根的效应Table 5 Effects of different concentrations of IBA,NAA,IBA+NAA on rooting

由表6 可知，与只添加不同配比激素的培养基组培苗相比较，增添有机物的培养基组培苗多数长势较好。在不同浓度IBA 的培养基中，1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+马铃薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭0.1 g/L 的培养基组培苗根系较粗且长，根生长速度较快，叶色较浓绿，生根率最高，达55.6%；在IBA+NAA 不同配比培养基中，1/2 MS+马铃薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性碳0.1 g/L+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L 或IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L 培养基的组培苗生根率较高，达到27.8%。因此，筛选出适合千里香生根培养的培养基配方为1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+马铃薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭 0.1 g/L。

表6 不同IBA、NAA 浓度和添加有机物对生根的效应Table 6 Effects of different concentrations of IBA and NAA and organic matter addition on rooting

2.6 移栽炼苗

种苗经炼苗移栽至泥炭土：黄心土：珍珠岩：钙镁磷肥（3∶2∶1∶0.2）的混合基质中，前期萎蔫严重，注意喷水保湿，3～4 d 后开始恢复生长，千里香生根瓶苗移栽成活率达85%，叶片变大，茎秆变粗，除1 株叶片变黄之外，其余叶色较绿，后移植于A100 杯继续生长，茎叶较为浓绿，茎秆健壮且木质化（图1）。

图1 千里香组培过程示意图Fig.1 Diagram of tissue culture process of Murraya paniculata

3 讨论

在种子萌发培养的研究中，其中生长素的种类及含量对外植体的生长具有重要作用［8］，不同培养基对同品种不同部位外植体的诱导也有较大差异［18］。本研究通过诱导促使千里香种子萌发率达62.5%。蒋健林等以四数九里香种子为材料研究不同质量浓度的6-BA、NAA、GA3、IBA 对外植体生长的影响，利用IBA 处理萌芽率最高，达50%［17］。本研究同样是以千里香种子诱导萌芽，较前人研究萌芽率有所提高。这可能与千里香基因类型不同，诱导所用的培养基和培养条件不同，从而影响了萌芽率。

增殖培养为后期大规模的工厂化育苗关键阶段，基本培养基和香蕉汁对组培苗的增殖影响明显［19］，在不同浓度范围内，不同的植物生长调节剂组合对芽的增殖分化有不同影响［20-22］。本研究得出最佳增殖与壮苗的基本培养基为MS 培养基，生长状态最好；最佳的增殖培养基其增殖系数为2.37。蒋烨以千里香大田苗诱导出的无菌丛生芽的最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，配方6-BA∶KT∶NAA=1∶1∶1 时增殖效果最好，增殖系数达到了9.63［7］。但在本研究中千里香的芽增殖系数仅为2.37，使用NAA 处理时，大多数组培苗产生愈伤组织与褐化现象，导致芽无法继续扩繁，而使用IBA 处理时相对增殖系数较高。与上述报道相比较，本研究的增殖系数相对较低，上述报道采用的是千里香茎段作为外植体培养，而本研究使用的是成熟种子所诱导的丛生芽作为增殖材料，这可能与试验材料的基因型不同及用作外植体的部位不同有关。

本试验壮苗培养的最佳培养基为MS+马铃薯汁30 g/L，此时芽苗平均高度增长可达1 cm，芽苗长势较好；千里香生根的适宜培养基为1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+马铃薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭0.1 g/L，生根率达55.6%，以培养的千里香无菌生根苗为材料，通过炼苗移栽后存活率达85%以上。蒋烨使用无菌苗进行生根培养得到的最高生根率为52%［7］。根据本试验观察，千里香的生根培养条件较高，与增殖阶段丛芽生长状态关系较大，本试验结果在千里香种子胚芽诱导、增殖及壮苗阶段获得了较好的结果，可为生产实践提供技术参考，且55.6%的生根率较前人研究有所提高，能满足实际生产的部分需求但仍有提升空间，有待进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，不同激素及浓度对千里香种子萌发和丛芽增殖过程影响显著，添加马铃薯汁和香蕉汁利于壮苗和生根培养。适宜千里香种子萌发的培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L，萌发率可达62.5%；最佳千里香增殖与壮苗的基本培养基为MS 培养基，生长状态最好；最佳的千里香增殖培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.15 mg/L，增殖系数为2.37；最佳的千里香壮苗培养基配方为MS+马铃薯汁30 g/L，此时芽苗平均高度增长可达1 cm，芽苗长势较好；适宜千里香组培苗生根的培养基配方为1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+马铃薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭 0.1 g/L，生根率达55.6%；以培养的千里香无菌生根苗为材料，通过炼苗移栽至泥炭土∶黄心土∶珍珠岩∶钙镁磷肥（3∶2∶1∶0.2）的混合基质中成活率达85%以上。