雪猪油巴布膏的制备工艺优选及质量评价

张志锋，李 丽，王君军，伍 椰，孔清泉

(1.四川省羌彝药用资源保护与利用技术工程实验室，四川 成都 610041；2.四川大学华西医院，四川 成都 610041)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是中老年人最常见的慢性退行性骨关节疾病[1]，临床症状表现为缓慢发展的关节疼痛、僵硬、畸形，严重者发展为关节功能障碍甚至残疾[2].据世界卫生组织统计，在全球60岁以上的老年人中，约9.6%的男性和18%的女性患OA[3]，OA在全球发病率约占世界人口的4%～13%[4].随着年龄的增长，OA发生率明显增加，我国60岁以上人群患病率达60%[5]，75岁以上高达80%，OA越来越成为受广泛关注的公共健康问题[2].OA的治疗主要以药物治疗为主，辅以非药物疗法.非类固醇类抗炎药和非甾体类消炎药作为治疗OA的一线首选药物，但长期使用会引起一系列不良反应.非类固醇类抗炎药导致严重的胃肠道不良反应，危害心脑血管和肾脏功能；对乙酰氨基酚等非甾体抗炎药的大量使用诱发上呼吸道并发症，导致消化道出血和增加心血管疾病的患病风险[1-2].这些副作用限制了药物的使用，中医疗法不失为一种较好的替代疗法.中医将OA归为“骨痹”范畴，多因年老体衰、筋骨失养导致风寒湿邪乘虚而入，致气滞血瘀，筋脉痹阻.中医外治法能有效缓解关节疼痛，且操作简便、副作用小[6].巴布膏是一种外用贴膏剂，有着悠久的应用历史，自20世纪80年代发展至今，中药凝胶贴膏得到快速发展.其具有载药量大、释药性能好、毒副作用小、无刺激、使用方便，可随时停药、揭贴舒适等特点，越来越成为备受欢迎的外用新剂型[7].在现代研究中，随着巴布膏辅料不断被研究和开发，新设备和新工艺不断被探索和问世，中药巴布膏质量有了较大地提升，巴布膏的众多优点凸显，应用范围也越来越广泛.

雪猪油，为松鼠科旱獭属动物喜马拉雅旱獭Marmota himalayanaHodgson、灰旱獭M.baibacinaBrandt、草原旱獭M.bobacMiiller、长尾旱獭M.caudataJacquemont的脂肪.出自《四川中药志》[8]，在《中药大辞典》[9]、《中华本草》[10]均有收录.旱獭主要分布于四川、云南、西藏、青藏高原地区，栖息于海拔2 800～5 000 m的高山草甸草原带.雪猪油味辛，性温.归脾经.祛风除湿，解毒止痒.主治风湿肿痛，湿热疮毒，皮肤溃疡，臁疮，体癣.在川藏高海拔地区，环境条件较为恶劣，高原缺氧、气温低且昼夜温差大，加之缺乏锻炼、营养结构不均衡，体质特征发生改变，血流动力学改变、骨矿密度改变等使住在高海拔地区的中老年人软组织对缺氧、寒冷的耐受力明显降低，更容易出现骨关节的退变，藏医常将雪猪油涂抹至患者膝关节周围治疗膝关节骨关节炎，但这种使用方法存在使用、携带不方便、易污染衣物、透皮吸收差等缺陷，未能得到广泛地推广应用.本研究拟对雪猪油进行提取、制剂工艺的优选，制成雪猪油巴布膏，为其进一步研究与开发提供参考.

1 仪器与材料

1.1 仪器

METTLER TOLEDO ME55电子天平(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司)；CZY-G初黏力测试仪(济南赛成电子科技有限公司)；恒温恒湿箱RTOP-268Y(浙江托普仪器有限公司)；HWS-12型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司).

1.2 材料与试剂

实验用雪猪油购自四川甘孜藏族自治州农户家，经西南民族大学青藏高原研究院张志锋教授鉴定为喜马拉雅旱獭Marmota himalayanaHodgson的皮下脂肪组织；紫草购自四川省成都市荷花池药材市场“老肖金钱草铺”；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，粘度600～3 000 mpa.s，Usp级，批号:RH228997)，聚丙烯酸钠(PAAS，平 均 分 子 量400～500万，批 号:RH215549)，甘油(批号:RH247443)，丙二醇(批号:RH261143)，高岭土(批号:RH219751)，甘氨酸铝(98%，批号:RH112883)，柠檬酸(批号:RH255069)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na，批号:RH260026)，均购自罗恩试剂有限公司；水为蒸馏水；水刺布固定空白帖购自一分利膏药贴布.

2 实验与结果

2.1 雪猪油的提取工艺研究

旱獭板油原料→预处理(解冻、清洗、沥水)→绞碎→称重→熬制→油水分离→雪猪油.雪猪油以张大、厚实、色黄白者为佳.

雪猪油提取率＝雪猪油质量/旱獭板油料质量×100%.

2.1.1 雪猪油提取工艺优化

要炼取油状的雪猪油，考虑到高温会破坏原料的化合物成分，影响制剂的疗效，所以选择避免高温的条件下对雪猪油的提取方案进行筛选.

将经过预处理(解冻、清洗、沥水)的旱獭板油用绞肉机绞碎，每份称取500 g，按照以下方案进行雪猪油提取工艺研究.

方案一:加入4倍量的水混匀，置于70℃水浴中2 h，8 000 r/min离心30 min，取上层油状样品，得到雪猪油.

方案二:直接将称取的旱獭板油置于容器内于90℃水浴中提炼2 h，8 000 r/min离心30 min，取上层油状样品，得到雪猪油.

方案三:加入2倍量的水混匀，在电炉上小火熬煮2 h，8 000 r/min离心30 min，取上层油状样品，得到雪猪油.

根据出油率及实际实验(见表1)，最终选择提取方法二作为雪猪油的提取方法.该方法下提取的雪猪油出油率高，不含额外的水分，不易腐败变质，便于后期的保存.

表1 不同提取方法下雪猪油提取率Table 1 Extraction rates of snow lard by different extraction methods

2.1.2 雪猪油巴布膏原料药的制备

称取紫草100 g，倒入山茶油1 L，使紫草完全浸没于山茶油中，浸泡至少一个月后，沥出油，方可使用.

雪猪油巴布膏的药物原料由雪猪油与紫草油1∶4的比例混合均匀而成.

2.2 雪猪油巴布膏的制备

依次称取处方量的EDTA-2Na、甘氨酸铝、柠檬酸、丙二醇研磨均匀，加入处方量的药物混匀作为A相；将处方量的PAAS、高岭土加入丙三醇中溶胀1 h，作为B相；称取处方量的CMC-Na加水充分溶胀后于55℃水浴溶解，得到C相.各相基质准备好后进行巴布膏的制备:先向C相中缓慢加入B相成分，边加边搅拌，待B、C相充分混合均匀后，缓慢将A相加入到B、C的混合物中，继续搅拌，使其混合均匀，再在55℃水浴中炼合20 min，然后趁热涂布于无纺布上，放置于室温下晾干，盖上盖衬层，即得雪猪油巴布膏.

注意搅拌时速度不宜过快，过快容易带进大量的气泡，也不能过慢，搅拌速度过慢会导致搅拌不均匀；此外，搅拌时间不宜过长，长时间搅拌，导致膏体黏度不佳.

2.3 基质处方筛选

巴布膏，以水溶性高分子材料为基质，加入药物后制成，其载药量较大，药物释放性能好，毒副作用小.巴布膏基质的选择是巴布膏成型性与质量好坏的关键，基质各成分的性能对于巴布膏质量的优劣具有重要的影响.所选用的基质应不影响主药的理化性质且具有一定的黏性，赋形性好，可反复揭贴且皮肤上无残存，对皮肤无刺激性，不产生过敏反应，稳定性强.本实验研究选择依从性较好的PAAS和CMC-Na高分子材料为骨架材料，再辅以润湿剂、填充剂、交联剂等制备雪猪油巴布膏.

2.3.1 均匀设计法优选基质配比

通过查阅文献资料[11-13]及前期预实验确定各基质用量的大体范围，考察PAAS、柠檬酸、CMC-Na、甘氨酸铝、甘油、高岭土、丙二醇、水八种基质对巴布膏成型性的影响，实验设计采用均匀设计法，按照U10*(108)均匀设计表对以上因素进行水平设计并开展实验探索.其中，各个实验处方中所含有的药物-基质配比和乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)用量是一定的，为药物:基质＝1:10，EDTA-2Na为0.1 g.

预实验发现，PAAS与水的加入量比例较小时，膏体太稀，赋形性及黏着力较差；加入量比例较大时，膏体黏度较大，易结块，不易涂布.随着高岭土用量的增加，膏体颜色逐渐变白，黏度增大，不易涂布.综合文献资料及预实验结果，设定均匀设计法各因素及水平考察范围如下:PAAS(X1)0.5～2.75 g、柠檬酸(X2)0.1～0.37 g、CMC-Na(X3)0.1～0.55 g、甘氨酸铝(X4)0.1～0.46 g、甘油(X5)6～24 mL、高岭土(X6)0.1～1 g、丙二醇(X7)1～3.7 mL，水(X8)4～22mL，各因素及水平见表2，实验方案设计如表3.

表2 实验因素及水平Table 2 Factors and levels of uniform design

表3 均匀设计表U10*(108)Table 3 Uniform design tableU10*(108)

2.3.2 评价指标、检测方法及评分标准的建立

本试验以赋形性得分、初黏力得分、综合感官得分和膜残留测定结果得分对巴布膏进行质量评价.

(1)赋形性的测定

雪猪油巴布膏的赋形性测定，参照《中国药典》2020年版[14]第四部通则贴膏剂项下【赋形性】测定方法进行.膏面无流淌现象满分为15分，其余以此为基准计算得分.

(2)初黏力的测定

参照《中国药典》2020年版第四部通则0952第一法，采用滚球斜坡停止法测定巴布膏的初黏力.记录雪猪油巴布膏能黏住的最大钢球号，以所有巴布膏中测得的最大值为15分，其余与之相比计算得分.

(3)感官评价指标

参考孙文静[11]对复方丹参巴布剂的外观评价及吕秋霞[12]对黄地巴布剂的感官评价，采用综合感官评分对制备的雪猪油巴布膏进行感官评价.雪猪油巴布膏的综合感观评价分为以下几个方面:外观、气泡状态、涂展性、反复揭帖性，具体评分标准如表4.

表4 感官评分标准Table 4 Sensory scoring criteria

(4)膜残留的测定

取雪猪油巴布膏1片，揭下盖衬层，精密称定重量后用水洗涤，直至盖衬无膏体残留，晾干，于105℃烘箱中干燥30 min，取出后迅速移至干燥器中，冷却30 min，再次精密称定盖衬层重量，减失重量即为膜残留量.根据以下标准(表5)对雪猪油巴布膏进行膜残留指标评分.

表5 膜残留测定评分标准Table 5 Scoring criteria for cataplasma residue determination

2.3.3 均匀设计实验及结果

照雪猪油巴布膏的制备项下方法制成巴布膏，以赋形性、初黏力、感官、膜残膏量为主要评价指标对巴布膏进行质量评价.结果见表6、图1.

表6 均匀设计实验及结果Table 6 Test and results of uniform design

图1 均匀设计实验因素水平及综合得分结果Fig.1 Experimental factor，level and comprehensive score of uniform design

对雪猪油巴布膏工艺优化结果进行多元回归分析，筛选最佳制备工艺.以综合得分为因变量，均匀设计方案中处方各因素为变量，利用SPSS 26.0统计分析软件进行多元输入回归分析，建立回归模型，模型回归方差分析结果见表7.综合得分的回归方程为Y＝53.465-47.922X3-0.751X5-12.468X6＋1.775X7＋1.653X8，R2＝0.609.由方程可知，雪猪油巴布膏的综合得分与丙二醇(X7)、水(X8)的加入量呈正相关，与CMC-Na(X3)、甘油(X5)、高岭土(X6)加入量呈负相关.再采用Excel 2010软件对以上回归方程进行规划求解，计算综合得分最高时各因素的最优组合.当X3＝0.15，X5＝18，X6＝0.3，X7＝2.5，X8＝12时，综合得分Y值最大，由此确定雪猪油巴布膏基质的处方比例.在回归方程中，变量X1、X2和X4系数为零，说明在考察范围内，PAAS、柠檬酸和甘氨酸铝的用量对基质综合评分的影响不大，可根据实际操作在考察范围内任意选择用量.综合考虑巴布膏制备的实际情况，最终确定雪猪油巴布膏基质的最优处方为PAAS 1.5 g，柠檬酸0.22 g，CMC-Na 0.15 g，甘氨酸铝0.34 g，甘油18 mL，高岭土0.3 g，丙二醇2.5 mL，水12 mL，EDTA-2Na 0.1 g.

表7 方差分析Table 7 Variance analysis

2.3.4 验证试验

按优选出的巴布膏基质处方，根据雪猪油巴布膏制备方法制备3批样品，对样品赋形性、初黏力、感官、膜残膏量进行测定并评分，计算综合得分，验证试验结果见图2、表8.结果表明，3批雪猪油巴布膏样品赋形性、初黏力、感官、膜残膏量及综合评分均无明显差异，工艺稳定可行、重复性好.巴布膏外观性状良好，具有一定的黏着性，可反复揭贴且无膏体残留，质量稳定、可控.

图2 雪猪油巴布膏工艺验证结果Fig.2 Result of verification test

表8 雪猪油巴布膏验证试验结果Table 8 Result of verification test

3 讨论

雪猪油是一种传统藏药，取自旱獭皮下脂肪组织提炼而成，藏医常将其涂抹至患者关节周围治疗OA.雪猪油中含有的大量油酸和n-9、n-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)，具有抗炎特性，可抑制抗炎因子的分泌，促进炎性反应产物的吸收，增加风湿性关节炎患者-3 PUFAs的摄入量，缓解OA症状[15].据中医分类，雪猪油属辛热药，性温；主风湿痹痛，湿热疮毒，皮肤溃疡.但由于雪猪油提取工艺及使用方法的限制，在临床上未能得到推广应用.本研究对雪猪油的提取工艺进行探究，选取得油量较高，油质较好的提取方案对旱獭板油进行提炼，并通过均匀设计方案优选巴布膏基质处方，探索基质辅料的配比对巴布膏成型性的影响，根据赋形性、初黏力、感官、膜残膏量的综合评分确定基质最佳配比，并将其制成雪猪油巴布膏.

巴布膏的基质是影响巴布膏成型和质量的关键因素.巴布膏基质种类繁，各作用基质又有多种材料可选择，每种材料性质和作用各有偏向[16-17]，对巴布膏基质的筛选不仅要考虑基质的种类，还要对各基质的比例及用量进行综合分析，需考察的因素较多，一般的设计方法远不能满足对条件的筛选要求，如正交设计仅对因素挑选部分有代表性的水平点进行试验，研究因素的范围较窄，且实验次数多[18-19]；星点设计存在考察因素有限、实验繁杂等缺陷[20-21].而均匀设计法可以对多个因素设计多个水平，研究因素的范围较宽，且实验次数少，实验的结果具有较好的代表性，能很好地满足对巴布膏基质处方的优化.同时，相对于正交试验，均匀设计法的数据分析涉及多元线性甚至非线性回归分析及对回归方程的优化计算，可靠性更高，应用更广泛.因此，在预实验的基础上，本研究以赋形性、初黏力、外观、气泡状态、涂展性、反复揭贴性、膜残留的综合评分值作为评价指标，采用均匀设计法对雪猪油巴布膏的基质处方进行优选.

综合比较各基质材料的性能特点，雪猪油巴布膏的骨架材料选用PAAS和CMC-Na；保湿剂为甘油和丙二醇；高岭土为填充剂；柠檬酸为络合剂；甘氨酸铝为交联剂，交联缓冲剂为EDTA-2Na.PAAS、CMCNa等高分子聚合物是巴布膏亲水性凝胶型骨架形体的基本组成物质，它们使膏体具有优良的粘结性能[22].填充剂也是膏体成型的重要物质，填充剂的加入可改善因水溶性高分子材料吸水产生的膏体过黏，保证膏体具有合适的黏着力.同时，在巴布膏的制备过程中加入交联剂及交联调节剂，它们通过产生交联固化反应，形成稳固的交联网，调节交联固化的反应时间和程度，增加基质的内聚力，使基质材料避免出现冷流、剥离残留、拉丝等现象[23].雪猪油巴布膏选用亲水凝胶型骨架，膏体含水量大，保湿剂的加入锁住膏体水分，促进皮肤的水合作用，同时保湿剂对基质的赋型性、黏附性以及药物的释放也有一定的调节作用.