5个棉蚜组织蛋白酶B基因克隆及在不同寄主专化型中的表达分析

刘伟娇，张肖丽，高雪珂，朱香镇，王 丽，姬继超，雒珺瑜，崔金杰，李东阳，张开心

(中国农业科学院棉花研究所，棉花生物学国家重点实验室，河南安阳 455000)

棉蚜AphisgossypiiGlover是一种世界性害虫(王丽等,2015)，是最具破坏性的害虫之一。在长期的自然选择过程中，棉蚜为适应生存条件进化出了不同的适应能力，形成了不同的寄主专化型(陈文胜等,1997)。研究表明，棉蚜种群在不同寄主上分化，在世界各地已经发现了多种寄主专化型，例如棉花型、瓜型或其他型(Adriaanetal.,1994;刘向东等,2002)。但在我国主要是棉花型和瓜型棉蚜的分化(孟玲等,1998)，并且还发现将两者进行相互转接后，均表现出存活率显著下降，不能建立种群的现象(孟玲和李保平,2001)。此外，还发现西葫芦CucurbitapepoL.寄主可改变棉蚜的寄主专化性，并对棉花型棉蚜以及瓜型棉蚜的寄主利用、寄主选择和定位以及外部形态的数值特征产生不同程度的影响(吴蔚,2013)。有研究发现西葫芦也可以作为中间寄主形成棉蚜在不同寄主植物间的相互转移通道(郑彩玲等,2007)。

不同寄主专化型蚜虫进化出了不同的寄主适应能力。在外部形态上表现为两种专化型棉蚜的触角在第三节长度、口针长度、头部宽度、腹管长度、退节长度、前足长度、中足长度以及后足长度等7个生态部位的长度有差异(麦麦提艾则孜·穆合塔尔和王东,2020)。有研究表明，棉花型棉蚜对接触刺激的反应比瓜型棉蚜敏感，两寄主型棉蚜对寄主的选择能力表现为瓜型棉蚜显著强于棉花型棉蚜(刘向东等,2004)。在生理生化上表现也不尽相同，寄主专化型蚜虫在不同寄主植物上表现出了不同的适应性，研究发现在花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim.、木槿HibiscussyriacusL.、石榴PunicagranatumL.、冬青IlexchinensisSims、棉花Gossypiumspp.上的棉蚜，其中棉花上棉蚜种群中具有较高的α-NA酯酶活力的个体多于其它4种寄主植物上棉蚜(谢佳燕等,2007)。让不同抗性程度的棉蚜取食棉花、木槿和南瓜Cucurbitamoschata(Duch.ex Lam.) Duch.ex Poiret 3种寄主作物，取食木槿各品系棉蚜的乙酰胆碱酯酶对甲胺磷敏感性均有所下降，并且在不同处理之间棉蚜AChE的酶学特性(Km值和Vmax)也发生了不同程度的改变，究其原因可能是寄主作物体内的次生物质对靶标酶乙酰胆碱酶存在不同程度的诱导作用，致使其酶学生化特性发生改变(李飞等,2002)。在分子水平上，发现COO2基因在棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜中表达水平不同(任柯昱等,2018)。而瓜型棉蚜体内原生共生菌Buchnera种群密度和菌胞数量都显著高于棉花型棉蚜，并且通过转录组测序发现，P450基因CYP302a1、CYP6a14、CYP4c1、CYP6a2和消化酶基因CL1593-1、CL382-1H、CL1471-2在黄瓜型棉蚜中表达量也显著高于棉花型棉蚜(张元臣,2016)。

组织蛋白酶(Cathepsin,Cath B)是主要存在于溶酶体中一种胞内蛋白酶，它的存在对有机体的生命活动至关重要。而到目前为止从组织蛋白酶A到Z都早已有报道。Cath B是一类半胱氨酸类蛋白酶，属于木瓜蛋白家族(刘任强等,2015)。广泛存在于细菌Bacteria、病毒、原生动物Protozoa、植物、昆虫和哺乳动物中。并且在胚胎发育的过程中，该酶参与了胚胎发育中卵黄蛋白的降解，为胚胎发育提供必要的营养物质氨基酸(罗梅等,2012)。由此可见该蛋白的缺失会影响昆虫的正常代谢，甚至导致死亡。营养物质分解代谢在昆虫胚胎发育早期是其主要的生物化学过程之一，探索在寄主转化中这一时期卵内蛋白酶活性，可以判定不同寄主对蚜虫专化型的影响。因此，研究CathB基因具有重要意义。

本文基于棉蚜转录组数据中的相关信息，克隆获得了5个高表达CathB基因的全长序列，分别命名为AgCb-1～5(GenBank登录号：MW819782-6)，并对5个基因进行了序列和进化树分析；同时分析了棉花型和黄瓜型两种寄主专化型棉蚜的这 5个基因在分别在棉花、黄瓜以及中间寄主西葫芦上不同发育阶段中的表达特性，比较了两种不同寄主专化型棉蚜在3种寄主中的表达差异，为进一步研究棉蚜寄主专化型形成的分子机理提供了重要信息。

1 材料与方法

1.1 供试植物

试验所采用的棉花品种为中棉所49，由中国农业科学院棉花种质资源中期库提供；黄瓜品种为新津优一号，购买于宁阳县金鑫种子销售中心；西葫芦品种为极早优美，购于市场。植物在人工气候室内种植，设定条件:温度26±1℃，相对湿度70%～80%，光周期L ∶D=16 ∶8。

1.2 供试棉蚜

供试验所用的棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜分别采自中国农业科学院棉花研究所东场试验田(114°42′E，36°11′N)的棉花和黄瓜植株上，通过分子鉴定技术鉴定其专化型(Zhangetal.,2018)，鉴定后的棉蚜单头饲养于温度为26±1℃，相对湿度为70%～80%，光周期L ∶D=16 ∶8的人工气候箱内，最终获得遗传背景一致的品系。

1.3 试验处理

将黄瓜型棉蚜和棉花型棉蚜的成蚜分别转接到离体的黄瓜叶、棉花叶上，将叶片的梗部插入1.8%琼脂的保湿培养皿中，盖上盖子后置于人工气候室中，24 h后移除成蚜，留下若蚜在叶片上生长。每隔2 d更换一次新鲜叶片以保证蚜虫的正常生长发育。连续收集棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜分别在不同寄主上1、2、3、4龄的若蚜和1、3、5、7日龄的成蚜。每个时期收集20头作为一个处理，共3个重复。将收集的样品储存在-80℃备用。再将棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜的成蚜分别接于离体的西葫芦叶片上，收样处理方法同上。

1.4 棉蚜总RNA的提取及cDNA的合成

棉蚜的总RNA的提取步骤按照TRIzol试剂(Ambion公司)说明书进行。使用NanoDrop 2000C型微量分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度、纯度及其完整性。利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)反转录试剂盒将上述不同棉蚜的RNA反转录成单链cDNA。

1.5 棉蚜Cath B基因的克隆

根据本实验室所建立的苗蚜和伏蚜转录组数据库信息(Zhaoetal.,2013)中选出表达量相对较高的棉蚜5个CathB基因，运用Primer Premier 5.0软件设计验证引物。AgCb-1上游引物5′-TATTTCAACAATGGTTAGAGTGT-3′,下游引物5′-TGGATTATACCGTAAGTTAGGTA-3′；AgCb-2上游引物5′-TGAGAAGGATATTAAATTATCATTAT-3′，下游引物5′-GAGTCCATCGGAATCGTC-3′；AgCb-3上游引物5′-AATATTTCGCATGACCGCTT-3′，下游引物5′-CATTGAGGAAAAAGCGATGATA-3′；AgCb-4上游引物5′-ACTGGTACACCAGCAGTTGTA-3′，下游引物5′-AACTAAAATTACAATACAGCAACA-3′；AgCb-5上游引物5′-GTTGGCGTTTCAGAAGTCA-3′，下游引物5′-ATCTCATCCGGTCAATCAAC-3′。PCR反应后将扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收并纯化，按照pEASY-T3 Cloning Kit 试剂盒(全式金)的说明书将其连接到pEASY-T3载体上，再将其转化至Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞，挑取单克隆进行测序。

1.6 生物信息学分析

运用网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测基因的OFR(Open reading frame)。运用在线软件ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质的理化性质。运用网站(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析蛋白质的结构域和保守位点，利用软件MEGA 7以邻接法(Neighbor-joining method，NJ)构建系统发育树，各分支置信度经由bootstrap法1 000次循环检验。

1.7 荧光定量PCR

使用Beacon Designer 7软件设计荧光定量引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将cDNA模板稀释成5个浓度梯度，进行标准曲线的制作，并计算各引物的扩增效率(表1)。内参基因选取棉蚜的甘油三磷酸脱氢酶GAPDH(GenBank登录号：KP676380.1)。荧光定量PCR反应使用GoTaq qPCR Master Mix(Promega公司)试剂盒进行。反应体系为qPCR MasterMix 10 μL、cDNA 模板1.0 μL、上下游引物各0.8 μL、无核酸酶水7.4 μL，混匀离心，放入荧光定量PCR仪中扩增。反应条件为95℃变性2 min；接着进行40个循环，条件为95℃ 15 s、60℃ 1 min。定量PCR仪器为Eppendorf公司的Mastercyclerep realplex荧光定量PCR仪。表达量的计算根据Ct值采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达水平，不同寄主型蚜虫各个不同龄期的CathB基因的相对表达水平均表达为棉花型1龄若蚜AgCb基因(设为1倍)的相对倍数。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR

1.8 数据统计

运用SPSS软件对棉蚜在不同寄主上的基因表达量进行数据统计和单因素方差分析(Duncan’s),差异显著性程度设为P<0.05。采用GraphPad Prism 8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 棉蚜5个Cath B基因克隆和序列特征分析

根据棉蚜转录组数据，通过基因克隆方法得到的5个CathB基因的全长cDNA序列(表2)，分别命名为AgCb-1、AgCb-2和AgCb-3、AgCb-4、AgCb-5，并对其相应的氨基酸序列特征进行分析比较。结果表明，CathB基因在N端结构差异性较大，但是在C端却有较高的同源性，并且还有两个结构域Propeptide_C1和Peptidase_C1A_CathepsinB和Gln、Cys、His、Asn 4个催化残基和S2特异性亚基，都有着较高的保守性(图1)。

表2 组织蛋白酶B基因家族基本信息分析Table 2 Basic information of the Cathepsin B family

图1 棉蚜Cath B基因与其他昆虫Cath B氨基酸序列多重比较Fig.1 Multiple comparison of amino acid sequences between Cath B gene and Cath B gene of other insects注：AgCb-1,棉蚜Aphis gossypii,MW819782;AgCb-2,棉蚜Aphis gossypii,MW819783;AgCb-3,棉蚜Aphis gossypii,MW819784;AgCb-4,棉蚜Aphis gossypii,MW819785;AgCb-5,棉蚜Aphis gossypii,MW819786;BmCb-1,家蚕Bombyx mori,BAB40804.1;MpCb-1,桃蚜Myzus persicae,DAA06115.1;ApCb-3,豌豆长管蚜Acyrthosiphon pisum,XP_029341239.1;BdCb-2,桔小实蝇Bactrocera dorsalis,JAC57277.1;DmCb-1,黑腹果蝇Drosophila melanogaster,NP_001259536.2.

将这5个棉蚜的CathB基因与其它昆虫的CathB基因的氨基酸序列以邻接法构建了进化树，结果显示，棉蚜的CathB基因与蚜科Aphididae桃蚜MyzuspersicaeSulzer的关系最近，与其它昆虫的同源性较低，分属不同支，与家蚕BombyxmoriLinnaeus的关系最远(图2)。

图2 棉蚜Cath B与其它物种的进化关系Fig.2 Phylogenetic relatedness of Aphis gossypii Cath B with other species注：进化树使用邻接法构建，各分支置信度经由1 000次Bootstrap检验。Bm，家蚕；Mp，桃蚜；Ap，豌豆长管蚜；Ps，扶桑绵粉蚧；Bd，桔小实蝇；Dm，黑腹果蝇；Ag，棉蚜。Note:The tree was constructed by using neighbor-joining method.Bootstrap support values were based on 1000 replicates.Bm,Bombyx mori;Mp,Myzus persicae;Ap,Acyrthosiphon pisum;Ps,Phenacoccus solenopsis;Bd,Bactrocera dorsalis;Dm,Drosophila melanogaster;Ag,Aphis gossypii.

2.2 5个棉蚜Cath B基因在不同寄主上的表达分析

2.2.1棉花型棉蚜5个CathB基因在不同寄主上的表达分析

利用荧光定量PCR技术检测了5个CathB基因在棉花寄主和转接西葫芦寄主上若蚜不同龄期和成蚜不同日龄的相对表达量，结果发现，AgCb-1基因在棉花上不同时期的相对表达量无明显变化；而棉蚜转接到西葫芦上后，除7日成蚜外，其它时期相对表达量均有所下降，并且7日成蚜表达量增加了5倍，具有显著差异(P<0.05)(图3)。AgCb-2基因除3日成蚜和7日成蚜在西葫芦上的相对表达量降低外，其它时期均表现为西葫芦高于棉花。而AgCb-3基因基本与之相反，5日成蚜与7日成蚜的基因表达量相比较于在棉花上有所增加，差异不显著(P<0.05)。AgCb-4基因在两个寄主上的相对表达量均具有先上升再下降的趋势，并且在棉花上3日成蚜时期达到最高值，而从棉花转接到西葫芦上后表现为在4龄若蚜达到最高值，并且在3日成蚜时期在两种寄主上的相对表达量有显著差异(P<0.05)。AgCb-5基因在两种寄主上的相对表达量除7日成蚜时期均表现为先下降再上升的趋势，并且相对表达量的最高值都在1龄若蚜时期。7日成蚜时期在棉花上的相对表达量接近0。而在转接到西葫芦上后这一时期相对表达量出现大幅度回升，但差异不显著(P<0.05)。

图3 AgCb-1、AgCb-2、AgCb-3、AgCb-4、AgCb-5在棉花和棉花转西葫芦上的相对表达量Fig.3 Relative expression of AgCb-1,AgCb-2,AgCb-3,AgCb-4 and AgCb-5 on cotton and cotton-to-zucchini注：1 L，1龄若蚜；2 L，2龄若蚜；3 L，3龄若蚜；4 L，4龄若蚜；1 D，1日龄成蚜；3 D，3日龄成蚜；5 D，5日龄成蚜；7 D，7日龄成蚜。柱上标有*代表基因表达量的差异显著(ANOVA，P<0.05)。Note:1 L,1st instar nymph;2 L,2nd instar nymph;3 L,3rd instar nymph;4 L,4th instar nymph;1 D,1st adult;3 D,3rd adult;5 D,5th adult;7 D,7th adult.The * on the column indicated significant differences in gene expression.(ANOVA,P<0.05).

2.2.2黄瓜型棉蚜5个CathB基因在不同寄主上的表达分析

5个CathB基因在黄瓜寄主和黄瓜转接西葫芦寄主上若蚜不同龄期和成蚜不同日龄的相对表达量结果发现：AgCb-1、AgCb-2和AgCb-3在黄瓜上的基因表达量基本一致，均表现为先上升、下降、又回升的趋势，并且AgCb-1、AgCb-2均在5日成蚜时期和7日成蚜时期分别达到最低值和最高值。在两种寄主上对比发现，AgCb-1和AgCb-2分别在3龄若蚜和3日成蚜时期后，相对表达量差异显著(P<0.05)。而AgCb-3在在黄瓜寄主上表现为在3日成蚜时期达到最高值，但转接到西葫芦上后基因的相对表达量均表现为成蚜时期高于若蚜时期，并且在两种寄主之间进行比较发现只在3日成蚜时期差异显著(P<0.05)，并且黄瓜上的相对表达量是转接到西葫芦上的2倍。AgCb-4和AgCb-5在两寄主上的表达量均在1龄若蚜时期达到最高，3龄若蚜时期表现最低，且差异显著(P<0.05)，但在两种寄主同一时期的相对表达量却并无显著差异。不同的是，3龄若蚜之后，AgCb-4的相对表达量明显上升(图4)。

图4 AgCb-1、AgCb-2、AgCb-3、AgCb-4、AgCb-5在黄瓜和黄瓜转西葫芦上的相对表达量Fig.4 Relative expression of AgCb-1,AgCb-2,AgCb-3,AgCb-4 and AgCb-5 in cucumber and cucumber-to-zucchini注：1 L，1龄若蚜；2 L，2龄若蚜；3 L，3龄若蚜；4 L，4龄若蚜；1 D，1日龄成蚜；3 D，3日龄成蚜；5 D，5日龄成蚜；7 D，7日龄成蚜。柱上标有*代表基因表达量的差异显著(ANOVA,P<0.05)。Note:1 L,1st instar nymph;2 L,2nd instar nymph;3 L,3rd instar nymph;4 L,4th instar nymph;1 D,1st adult;3 D,3rd adult;5 D,5th adult;7 D,7th adult.The * on the column indicated significant differences in gene expression.(ANOVA,P<0.05).

3 结论与讨论

棉蚜作为世界性棉花害虫，其相关的研究一直广受关注。而组织蛋白酶B在昆虫代谢过程中发挥着重要作用。据研究显示组织蛋白酶B参与生命活动中许多生理、病理性反应。可以被巯基试剂抑制，可以降解血红蛋白、血清蛋白、卵黄磷蛋白、层粘蛋白和IV型胶原等细胞外基质成分，从而破环一系列组织屏障。在医学方面有研究显示，恶性肿瘤和癌症的诊断及治疗中组织蛋白酶B有望成为新的热点。研究发现CB基因可抑制肝癌细胞的迁移(吕晓丹等,2018)。此外，组织蛋白酶B抑制剂CA-074Me可通过抑制其表达，减轻小鼠的心肌损害，提高感染小鼠的存活率(于小华等,2005)。而在昆虫方面，大多数研究对象为棉铃虫Helicoverpaarmigera(杨晓梅,2005)、烟叶蛾Helicoverpaassulta(赵艳艳等,2008)、扶桑绵粉蚧Phenacoccussolenopsis(罗梅等,2012)、家蚕(蔡翔云,2014)等昆虫。杨晓梅等(2005)从棉铃虫卵中鉴定并纯化出了棉铃虫组织蛋白酶B，并证实该酶参与了棉铃虫胚胎发育过程中卵黄蛋白水解等生命活动。有研究还发现，淡色库蚊体内也存在组织蛋白酶B，并且参与了卵细胞的降解(Uchidaetal.,2001)。埃及伊蚊Aedesaegypti雌性成虫在卵子发生过程中随着卵黄沉积，脂肪体会产生一种半胱氮酸组织蛋白酶B(Choetal.,1999)。

本研究从棉蚜的转录组数据库中获得5个高表达的CathB基因AgCb-1、AgCb-2、AgCb-3、AgCb-4和AgCb-5，通过系统进化树的分析结果可得知：棉蚜的CathB基因与蚜科昆虫的同源性较高，而与其它昆虫在进化树上分属不同分支，说明棉蚜的CathB基因功能与其它昆虫产生了一定分化。本研究还发现5个CathB基因在两种寄主专化型棉蚜的不同发育时期均有表达。但每个基因的表达都各有各的特点，例如棉花型棉蚜在棉花寄主上AgCb-1、AgCb-3、AgCb-5基因不同时期的表达量并没有显著的差异。而AgCb-2、AgCb-4基因的表达趋势均为先升高再下降，且均在3日龄成蚜达到最大值，并且与其它时期有显著差异。黄瓜型棉蚜在黄瓜上AgCb-1、AgCb-2、AgCb-3的表达趋势为先升高再下降再升高，分别再7日和3日成蚜达到最高值。而AgCb-4和AgCb-5都表现为在1龄若蚜达到最高值。其中AgCb-4先表现为下降趋势，在3日成蚜达到第二个峰值。而AgCb-5则表现为持续降低的趋势；这也与杨晓梅(2005)在棉铃虫中的研究有所不同。分别将棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜转接到中间寄主西葫芦上后，棉花型棉蚜AgCb-1、AgCb-4基因分别在7日龄或3日龄成蚜时期显著升高，而其它基因则无显著差异。黄瓜型棉蚜AgCb-1基因除5日龄成蚜转接后表达量显著升高外，3龄若蚜之后的时期均转接前大于转接后。而AgCb-2、AgCb-3基因在3日龄或3日龄之后表达量转接后大于转接前。

有关棉蚜寄主专化性的讨论，长期以来一直广受关注，但是关于分子水平上尤其是组织蛋白酶B的研究却鲜有报道。植物次生化合物对棉蚜寄主专化的影响推测黄瓜、棉花以及西葫芦叶片内的次生化合物种类及含量的差异可能影响不同专化型棉蚜的寄主选择(王丽等,2015)。棉蚜唾液腺蛋白armet基因在不同专化型棉蚜转接试验的作用，表明该基因分别在成蚜和若蚜中发挥了不同作用(任柯昱等,2018)。棉蚜根据不同的繁殖方式可以将生活史划分为夏季以孤雌蚜繁殖、秋季产生性蚜产卵越冬的全周期型和以孤雌胎生蚜越冬的不全周期型、产雄性蚜的不全周期型以及会产生有性世代但仍进行孤雌生殖的中间型(晁文娣等,2019)。本试验的棉蚜为孤雌胎生蚜；而前人所研究的多为卵生昆虫，有研究表明在蚜虫胎生卵母细胞和胚胎中没有或者很少有卵黄。而组织蛋白酶B主要是参与卵黄蛋白降解，调节昆虫的胚胎发育，进而影响在寄主植物上的适应性。De Barro提出，蚜虫对寄主植物形成的专化性可能是寄主条件的长期选择，发生遗传物质的改变，进而导致代谢酶的变化，最终形成寄主专化型(De Barroetal.,1995)。再结合本试验不同专化型棉蚜在不同寄主上的基因表达量分析，发现CathB基因确实在棉蚜的寄主转换中存在作用，推测组织蛋白酶B不仅能对卵生昆虫的生殖有调节作用，对胎生棉蚜尤其是在寄主转换中也具有一定的调节作用，但其具体功能还需进一步研究和验证。